乙醇生产酵母菌的选育

现代食品科技Modern Food Science and Technology008,vo24,No6乙醇生产酵母菌的选育杨登峰,关妮,米慧芝,陆崎,肖代俊,黄日波(广西科学院工业微生物技术研究中心,广西南宁530003)摘要:巴西然料乙醇取得巨大成功,原油价格的不断攀升,以及糖价的下跌,以甘蔗为原料的燃料乙醇已经向世人展现出良好的市场潜力.但目前我国国内还尚未见到甘蔗汁乙醇的研究,作为一项储备技术,对甘蔗汁乙醇技术的研究具有十分重要的意义。本文对商业化和实验宣筛选的多株酵母发酵甘蔗汁能力进行了研究.结果表明:s酵母生长速度较快,εw酵母产酒率较高,εw酵母死亡率较低。综上,sy酵母和gw2酵母更适合于甘蔗汁发酵酒精的生产关键词:乙醇;酵母;甘藻汁;发酵中图分类号:TQ926;文献标识码:A;文章篇号:16739078(2008)06050603Breeding of a High ethanol-producing Yeast StrainYANG Deng-feng, GUAN Ni, MI Hui-zhL, LU Qi, XIAO Dai-jun, HUANG Ri-boIndustrial Biotechnology Research Center, GuangXi Academy of Sciences, Nanning 530003, China)Abstract: The production of ethanol by sugarcane juice fermentation had great meaning to the development of our economy due to therising oil price and lower sugar price. In this paper, a high ethanol-producing strain was screened from several yeasts. Two yeast(gw2 and sywere found to be suitable for the ethonal production via sugarcane juice fermentation for their higher ethanol-producing capabilities and lowermortality rateKey words: ethanol; yeast; sugarcane juice; fermentation国际油价飞速上涨,屡创新高,这对以石油为主准正式公布。2003年,我国燃料乙醇年产仅有7万吨,要能源进行生产消费的各个国家无疑带来巨大的影至2006年,已达到年产100多万吨,专家预计2010响。引发油价上涨有许多种原因,然而这种情况导致年乙醇产能有望达到700万吨,我国已迅速成为仅次国际社会对能源问题更加关注、重视,并积极开展替于巴西和美国的全球第三大燃料乙醇生产国代能源、可再生能源的研究和开发,已经是迫在眉睫以糖质原料生产燃料乙醇,一直由于高昂的原料的当务之急。成本,而被人们所忽视。广西作为全国最大的蔗糖生燃料乙醇的生产与使用在国际上已有多年,巴西产基地,年产蔗糖占全国总量的60%以上,甘蔗的种是世界上最大的燃料乙醇生产国和消费国之一。到植面积达83.84万公顷,甘蔗产量5925万t。然而,2006年,巴西的燃料乙醇产量已达到170亿升,其主在广西乃至国内尚未见以甘蔗汁为原料发酵生产燃料要原料为甘蔗及其副产物,占甘蔗总产量的50%。乙醇的研究报道。甘蔗乙醇作为一项储备技术,非常美国则是近年来燃料乙醇发展速度最快的国家。从有必要进行研究。2000年到2006年的7年里,燃料乙醇产量从16亿加本实验以目前商品化的高温活性干酵母、市面上仑增加到49亿加仑,增加幅度超过3倍。随着世界能常用的酿酒酵母和本实验室自行筛选的高温酵母为出源危机的日益突出,美、巴、英、日、加、澳、印等发菌株,以甘蔗汁为原料进行单批次的酒精发酵。在国家都制定发展本国的燃料乙醇计划。燃料乙醇已成发酵过程中,研究了酒精发酵和酵母生长的各种参数,为世界各国发展再生能源的潮流,其发展空间巨大。其中包括酵母的生长速率、产酒率和死亡率等。通过我国在2000年启动燃料乙醇计划。2001年4月2这些参数的综合比较,优选出适合甘蔗汁发酵的酵母日,《变性燃料乙醇》和《车用乙醇汽油》两项国家标为我们今后利用基因工程手段改造酵母提供优良的出收稿日期:200801-16发菌技支撑计划资助项目(20007805):桂科攻0a0)关H中国煤化工燃料乙醇提供相CNMHG作者简介:(1979-),男助理研究员,硕士,主要研究方向:微生材料和方法现代食品科技Modern Food Science and Technology008. VoL24, No 61.1材料及菌种新鲜甘蔗汁由广西农垦集团思源酒业和广西农业2结果与分析科学院甘蔗研究所惠赠。葡萄糖、硫酸、尿素、磷酸、2.1酵母不同时期的生长速度次甲基蓝均购于上海国药集团化学试剂有限公司,分酒精发酵是一个群体的结果,酵母数高必然导致析纯。 Yeast extract, tryptone购于 Oxoid公司。高的发酵速度。因此,酵母的生长速度快慢直接关系安琪酿酒髙活性干酵母购于食品添加剂市场,到发酵速度的快慢gw2为本实验室保藏,酿酒酵母sy由广西农垦集团思酵母的生长速度分为在酵母种子液中的生长速源酒业惠赠,酿酒酵母As2116和As2189购于中度和在酵母发酵液中的生长速度。酵母的种子液培养国普通微生物菌种保藏中心基为YPD培养基,因而可以用菌体浓度反映酵母生12主要仪器长速度,菌体浓度的测定方法见1.5。通过测定,结果摇床,pH计,气相色谱,紫外可见光分光光度如图1所示,在5株酵母中,sy酵母的菌体浓度在各计,显微镜个时期基本都是最高的,其余4株酵母基本差别不大。13培养基及培养条件在发酵24h后,5株酵母基本达到同一个水平的浓度种子培养基:YPD( Yeast extract10%, stone所以,酵母生长速度最快的是sy酵母。酵母发酵培养20%,葡萄糖20%)。基为甘蔗汁,由于在甘蔗汁中培养酵母,无法用分光发酵培养基:新鲜甘蔗汁。光度计法测定菌体浓度。因此,采用直接计数的方法种子液培养条件(一般酵母):28℃,160rmin;一用细胞数来衡量酵母的生长情况。结果表明,在甘发酵液培养条件(一般酵母):30℃,120rmin,8h蔗汁中的生长情况基本和在YPD中相同,sy酵母的后,静止。生长仍是略快于其它酵母,如图2所示。种子液培养条件(高温酵母):30℃,160rmin;发酵液培养条件(高温酵母):34℃,120rmi,后,静止。14发酵实验■安琪从平板上挑取单菌落,接入含有3~5 mL YPD的指形瓶中,过夜培养。再以1%的接种量,转接到含◆As2.116100mL发酵培养基的250mL的锥形瓶中,每隔4h●As2.1189取样1次,发酵24h后停止取样15菌体OD值的测定方法时间h开启 Beckman DU800紫外一可见光分光光度计,图15株酵母在YPD中不同时间的0。值以未接种的YPD培养基为空白对照,4h后取样品测Fig.I The OD value of different time of five yeasts in YPD其oDω值,为确保其准确性,将数值维持在02-0.8之间。以后每隔4h测1次OD6值,并记下读数。16菌体细胞直接计数的测定方法菌体细胞数用血球计数板直接计数并计算。■安琪17酒精含量的测定方法使用 Agilent6890的气相色谱仪进行测定,测定◆As2.116方法为内标法As2.11891.8死亡率的测定方法采用美蓝染色法进行测定。取0.1%美蓝溶液1滴置载玻片中央,再取稀释后样液1滴混合,静止染色图25株酵母在甘蔗汁中不同时间的细胞数3-5min,加盖玻片,在显微镜下(400×)观察并计数中国煤化工 me of five yeasts in被染色的酵母细胞数和总细胞数,连续观察56个视野进行计算CNMHG死亡率=被染色细胞数总细胞数产酒率是是酵母发酵能力的主要指标之一,酒度现代食品科技Modern Food Science and Technology2008, vol 24, No6高说明酵母发酵能力强,糖的利用能力强。和24h时。如表1所示,gw酵母的死亡率较低,同由图3可以看到,gw2酵母的酒精产量最高,同样是高温酵母的安琪酵母也表现出较低的死亡率,这时,几株酵母均表现出良好的发酵蔗糖能力。大约在可能和本实验采取了较低的温度有关。20-23h的时候,达到酒精的最大产量;在发酵到25h表15株酵母不同时间的死亡率后,酒度开始回落,说明酵母已经利用完蔗糖发酵酒精。在没有碳源的情况下,酵母利用酒精为碳源进行m“自身营养的供给。死亡率%、20h0500001810522.5012.524h1.6014456033.8228.2110.03结论■安琪综合以上这些因素,sy酵母和gw2酵母比较适合发酵甘蔗汁生产酒精。◆As2.I16●As2.1189参考文献0.010[1] Andretta M.G. S, Andretta SR, Steckelberg C, et al. Bioeth时间hanol-Brazil, 30 years of ProalcooU]. Intern Sugar, 2007, 109图35株酵母不同时间的酒度(1299:195-200Fig. 3 The alcohol degree of different time of five yeasts[2]夏芸徐萍江洪波等巴西生物燃料政策及对我国的启示23死亡率生命科学2007,19(5):482485酵母的生长过程中,死亡是不可以避免的。但是,[3沈萍范秀容李广武微生物学实验M高等教育出版社在正常的生产过程中,死亡率过高势必影响到酵母正1998:9092常的酒精发酵。因此,对死亡率必须进行控制。对5[4]张龙翔生化实验方法和技术M北京民教育出版社株酵母发酵后期的死亡率进行了测定,主要是在20h上接第534页通过对尿苷产生菌Tcl42的5罐分批发酵数据进447449行分析,建立了菌体生长、基质消耗、产物形成的动[ Lin pei-Y吗 g, Whang Liang-Ming, Wu Yi-Ru, et al力学模型。利用 MATLAB软件对菌体浓度、残糖量、Biological hydrogen production of the genus Clostridium:产物浓度数据进行非线性拟合,求解出动力学模型的参数,通过对所建立模型进行F检验,结果显示拟合效International Journal of Hydrogen Energy, 2007, 32(12):1728-果显著,此模型和参数可以较好的反映菌株Tcl42的1735菌体生长、底物消耗和产物生成的变化规律。[6] Altiok Duygu Tokatli, Figen Harsa, Sebnem. Kinetic mode参考文献casei (NRRL B-441)[]. Chemical Technology and Biote[l]姚志湘伍时华陈宁等L亮氨酸分批发酵动力学研究[hnology2006817:1901197广西工学院学报2003,143).5-l1[7 Carine Bideaux, Sandrine Alfenore, Xavier Cameleyre, et al.[2]程远超刘康乐徐庆阳尿苷产生菌的选育[门现代食品科Minimization of Glycerol Production during the High-Performance Fed-Batch Ethanolic Fermentation Process in3]杜连禅工业微生物实验技术№天津科技技术出版社,a Metabolic Model asPrediction Too). Appliednvironmental Microbiology,[4 Pratima Bajpai, Argyrios Margaritis. Kinetics of ethanol"V凵中国煤化工production by immobilized Kluyveromyces marxianus cells at [8]CNMHG法测定牌胃康胶囊concentrations of Jerusalem artichoke juice冰日a厘[四中约态528(1)3536U]Applied Microbiology and Biotechnology, 1987, 26(5)