聚乙二醇定点修饰集成干扰素突变体Ⅱ

中国生物工程杂志China Biotechnology ,2008 ,28(4):17 ~20聚乙二醇定点修饰集成干扰素突变体II *牛晓霞'，2周敏毅2刘金毅子”孙超钟茜‘吴晓东'(1中国科学院研究生院北京100049 2 北京三元基因工程有限公司北京102600)(3中国药科大学药学院南京210000 4 中国药科大学中药学院南京20009)摘要目的:用聚乙二醇(PEG)修饰集成干扰素突 变体I ( IFN-Con-m2 ,IIFNm2) ,通过纯化获得新型修饰分子并对该分子进行抗胰蛋白酶水解稳定性及初步药代动力学研究。方法:将mPEG2000定点偶联到IlFNm2的第86位Cys残基上,修饰后的产物经CM层析后,以SDS-PAGE考察其纯度,用WISH-VSV系统进行生物活性测定;在0.1%胰蛋白酶条件下考察体外抗酶解稳定性;并以SD大鼠进行初步药代动力学研究,绘制血药浓度-时间曲线。采用3P87软件进行数据拟合,分析药物动力学参数。结果:干扰素修饰率约为50%,且绝大多数以单修饰体( mono-PEC- IIFNm2)形式存在;提纯后mono-PEC-IIFNm2的纯度大于98% ,比活性约为修饰前IIFNm2的1%。抗胰蛋白酶水解试验表明:30min后，IFNm2抗病毒活性残留为8%,mon-PEC-1IFNm2为41%。初步药代动力学研究显示:lIFNm的消除半衰期为(1.57 +0. 34) h, mono-PEC-1IFNm2为(18.0土4.0)h。结论:成功地偶联了PEC和IIFNm2,建立了mono-PEC-IIFNm2的纯化工艺，PEG修饰能增加IIFNm2的体外抗胰蛋白酶水解稳定性,并显著延长体内半衰期。关键词集成干扰素突变体 定点聚乙二醇修饰 药代动力学 半衰期中图分类号Q503干扰素a能够治疗多种肿瘤和病毒性疾病,但是1材料与方法由于血清半衰期太短,病人需要隔日甚至每日注射才能达到理想的治疗效果。1.1材料聚乙二醇化技术是一种改善治疗性蛋白质在体内人羊膜细胞( WISH)、水泡性口炎病毒(VSV),为运输的有效方法,经临床验证, PEG修饰可以显著改善三元基因工程有限公司保存。mPEC20000购自北京键蛋白质类药物体内药代动力学性质|1-3)。凯科技有限公司,IFNm2原液为三元基因工程有限公本课题组曾利用定点突变技术,构建集成干扰素司生产。DEAE Sepharose FF, CM Sepharose FF购自突变体I (IFN-Con-m2 , IlFNm2),在86位引人一个Amersham Pharmacia公司。Cys,获得兼具高活性和可用PEG定点修饰的干扰素新SD大鼠,250 ~300g,雌雄各半,购自协和动物所实分子(。验动物中心。本文拟在上述研究的基础上,利用马来酰亚胺1.2方法PEG衍生物对多肽分子内的Cys残基进行定点修饰，1.2.1 IFNm2的浓缩将IFNm2用A液(25 mmol/并对修饰产物进行抗胰蛋白酶稳定性研究和初步药代L Tis-HCl pH8. 0)稀释后上样到DEAE Sepharose FP动力学试验,为临床开发提供试验依据。层析柱,上样量e 50mg/ml填料。先用2个柱体积的A液冲洗中国煤化工:(25 mmol/L PB收稿日期:2007-12-12修回日期2008-01-21pH7.6)HC NMH GPB + 0.5mol/L●北京市科技计划重大专项( D0205001040321)资助项目NaCl pH 7.6)洗脱，收集洗脱峰即为浓缩的IIFNm2。#通讯作者,电子信箱:niuniuam@ sobu. com1.2.2IFNm2的PEG修饰反应体系中lIFNm2浓.18中国生物工程杂志China BiotechnologyVol. 28 No. 42008度约为10mg/ ml , IFNm2与mPEG20000摩尔比为1:2，于其理论分子量。计算并称量mPEG粉末溶入一-定体积的B液,迅速与__.2浓缩IFNm2混合,置于2~8C ,50r/min搅拌12h后，muli-PEClated IFNm2用D液( lmo/L醋酸溶液)调节反应体系pH到5.0以下以终止反应。用12% SDS-PAGE ,碘染和蓝染两种染mono-PEClated IFNn2mPEC20000色方法5.1)检测修饰率。1.2.3修饰产物的分离纯化 将反应混合物用 E液(25 mmol/L AAB pH4. 5)稀释20倍上样到CMunnodifed 1IFNm2Sepharose FF层析柱。上样结束后先用E液冲洗2~3个柱体积,再用F液(25 mmol/L AAB + 70 mmol/LNeCl pH4.5)冲洗8~10个柱体积,然后用C液(25圈1修饰产物的SDS-PAGE(碘染)Fig.1 SDS-PAGE analysis of conjugatesmmo/L AAB + 0.2 mol/L NaCl pH4. 5)洗脱，收集洗of PEG and IIFNm2( iodine staining)脱峰组分;最后用H液(25 mmol/L AAB + 0.5 mol/L1: Conjugate solution; 2: mPEG20000NaCl pH4. 5)洗脱,收集洗脱峰。洗脱产物用12% SDS-PAGE检测纯度。kDs1.2.4生物活性测定 用CPE法!"进行生物活性测定,用Lowry法'"]进行蛋白含量测定,两者相除计算比nono-PEClated IFNm243.0活性。1.2.5体外抗胰蛋白 酶水解试验分别取 IFNm2和31.0mono-PEG-IIFNm2各2ml ,加入0. 25%胰蛋白酶溶液使0.1其终浓度为0.1% ,混匀后置于37C,于0,2,5,10,15,unnodifed IFNm220 ,30 ,60 ,90min取样,每次取样后立即与含10%胎牛14.4血清的MEM培养基等体积混合均匀,冻存于-20C。待所有样品取完,用CPE法检测样品中活性保留。绘图2修饰产物的SDS-PAGE(蓝染)制生物保留-时间曲线。Fig.2 SDS-PAGE analysis of conjugates of PEG1.2.6 初步药代动力学试验 取SD大鼠8只,雌雄and IIFNm2( stained by coomassie brlliant blue)各半随机分成2组,分别为IIFNm2组和mono-PEC-1: Conjugate eolution; 2: IFNm2; 3: Protein markerIIFNm2组,按临床推荐人用剂量(3MIU ,5 x 10^IU/kg)2.2修饰产物的分离纯化的约500倍皮下注射给药。IlFNm2 组取血时间点为:修饰产物经CM Sepharose FF层析柱进行分离纯化。0, 0.5, 1, 2, 4, 10, 24h;mono-PEG-IIFNm2组取血时洗脱先后经F液G液和H液洗脱。其中F液主要用于间点为0, 0.5, 1,2,4,8, 12, 24, 48, 72, 96, 120,洗脱多修饰体( muli-BEC-IIFNm2) ,H液用于回收没有144h。在设计的时间点眼底取血约0. 4ml,离心后血清修饰的千扰素,on-PE-IFNm2则主要存在于G液中，样品放置在70C保存,CPE法[”检测各血清样品中千经非还原性SDS-PACE检测,纯度高于98% (图3)。扰素的浓度,绘制血药浓度时间曲线。采用3P87软件2.3生物活性测定进行数据拟合，,分析药物动力学参数。采用CPE法,利用WISH-VSV系统测定修饰前后2结果干扰索的活性,结果见表1。表1 FNm2 和PEG-IIFNm2的生物活性2.1 IIFNm2 的PEG修饰L Im0no-PEG-IFNm2经浓缩的IFNm2样品，与mPEC20000在适宜的中国煤化工二t活性/(IU/mg)条件下进行修饰反应,修饰后经SDS-PAGE检测发现TYHCNMH G410.73x10干扰素修饰率约为50%,修饰产物多以mono-PEG-mono-PEG-IIFNm25.61土0.59x106IIFNm形式存在(图1,2)。修饰产物的表观分子量大2008 ,28(4)牛晓霞等:聚乙二醇定点修饰集成干扰素突变体I19kDa .炙2 IIFNm2及mono-PEG-IIFNm2的药代动力学参数表生Table 2 Pharmacokinetic parameters43.031.0PK参数IIFNm2mono - PEC - IFNm2tl/2Ka(h)0.25 t0.1115.0+3.720.1t1/2Ke(h)1.57 +0.3418.0+4.0Tpeak(h)0.78+0. 1524.3+3.514.1Cpeak( IU/ml)23823.7 +3725.526941.7 +4853. 1AUC( IU●h/ml)76230.8士14407.3 1744758. 0 +258623.465.59 +14.2115.47 *3.38图3非还原 性SDS-PAGE检测纯化的3讨论mono-PEG-IIFNmFig,3 Analysis of purified monopegylated目前，已有PEG-Intron ( Schering-Plough)和IIFNm2 by nonreductive SDS-PAGEPEGASYS( Roche)两种氨基修饰的PEG干扰素a2产1 ;Protein marker; 2: mono-PEC-1IFNm2;品上市,PEG干扰素在临床应用中已得到越来越广泛3: muli-PEC-1IFNm2; 4: IFNm2的研究091。在新药研发阶段,与以往将Iys作为修mono PE-IFNm2的比活性大于5.0 x 10° IU/mg,饰位点的非定点修饰不同,因为具有工艺简单和质量约为修饰前IIFNm2的1%。易控的优点,以Cye作为修饰位点的定点修饰受到越来越多的关注(2-14)。2.4 体外抗胰蛋白酶水解试验酶解反应后,用CPE法检测样品的保留活性,绘制相对于Lys非定点修饰,Cys定点修饰条件较为固活性保留时间曲线(图4)。试验表明: 15min后,定,因此本研究没有过多的进行修饰条件摸索。我们IFNm2抗病毒活性保留为25% , mono-PE-IFNm2为注意到高浓度的PEG和IFNm2可以增加修饰率,但高75%;30min后,IFNm2抗病毒活性残留为8%,mono-度的IlFN1m2也会使二聚体大大增加,可能是由于高浓PEC-1IFNm2 为41%。度增加了干扰素分子间的碰撞机会所致。20 [在多数PEG修饰蛋白药物的研究工作中，因为PEG改变了蛋白的理化性质,其纯化工艺的建立都是.0080 t困难的,本研究采用分步洗脱的方式得到高纯的单修60 t饰体,方法简便,可操作性强。为考察药物的半衰期,本研究进行了体外抗胰蛋白酶水解试验和大鼠初步药代动力学试验。研究发20 t现:PEG修饰后,IFNm2体外抗胰蛋白酶水解能力显著206C8100增强;经3P87软件拟合发现IFNm2及其PEG衍生物时间/min在SD大鼠体内的代谢规律符合-级吸收的一房室模图4活性保留-时间曲线型。PEG化可显著改善IFNm2的药代动力学性质,与Fig.4 Curve of retention ativity-timeIIFNm2相比,mPEG- IFNm2的吸收半衰期、达峰时间、一◆- :IFNn2;-I -: PC-1IFNm2消除半衰期显著延长;药时曲线下面积显著增加;清除.5 初步药代动力学试验率显著降低。可见,PEC化可以延长IFNm2的体内平.以SD大鼠皮下注射给药2.5x10'lU/kg,眼底取均存留时间,降低清除率。血,用CPE法检测各血清样品中干扰素的浓度,绘制血我们注意到修饰后比活性降低较多,约为修饰前药浓度时间曲线(图略)。采用3P87软件进行数据拟IFNm2中国煤化工重要的活性位合,分析药物动力学参数(表2)。研究显示:单修饰体点”]。|Y片CNMHG活性较高,mono-的消除半衰期为修饰前的11. 5倍,清除率显著降低。PEC-IIFNm2仍有较高的比活性;而且IIFNm2分子内含有包括86位Cys在内的若干IFNalb的保守序列,我20中国生物工程杂志China BiotechnologyVol. 28 No. 42008们期待mono-PEC-1IFNm2有较低的临床不良反应。2005. Appendix 56 ~57[8]中国药典委员会编.中华人民共和国药典.2005 版三部.北参考文献京:化学工业出版社, 2005.附录30Chinese Pharmacopoeia Comite. Chinese Pharmacopoeia,[1] Molineux G, Kinsler 0, Bridell B, et al. A new fom of2005 Edition Volume M. Beijing: Chemical Industial Pree,filgrastimn with sustained duration in rivo and enhanced abity to2005. Appendix 30mobilize PBPC in both mice and humans. Exp Hematol, 1999,[9] Lai L, Hui C K, Leung N, et al. Pegylated itereren alpha2a27 :1724 ~ 1734(40 kDa) in the treatment of chronic hepatis B. Int J[2] Bailon P, Plleromi A, Schaffer CA, et al. Rational design of aNanomedicine, 2006, 1(3) :255 ~262potent, long-acting form of interferon: a 40 kDa branched10] Sifman ML, SuterF, BeconBR, et alPeginterferon alfa-polyethylene eycal-conjugated iterferon a2a for the treatment2a and ribavirin for 16 or 24 weeks in HCV genospe2or3. Nof hepatitis C. Bioconjugate Chem, 2001, 12:195 ~202Engl J Med, 200, 357(2):124 -134[3] BellSJ, Fam C M, Chlipala E A, et al. 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LIU Jin-yi'SUN Chao' ZHONC Qian' WU Xiao dong'(1 Graduate Univesity of Chinese Academy of Sciences Bejing, 10049 , China)(2 Beijing Tri-prime Genetic Engineering Co. lId. , Beiing 102600, China)(3 Pharmaceutical Science Department, China Phamaceutical University, Nnjjing 210009, China)(4 Chinese Traditional Pharmacy Department, China Pharmaceutical University , Nanjing 210009, China)Abstract Recombinant interferon alpha ( IFN-alpha) has been proven useful for treating a variety ofhuman cancers and viral diseases. Because of its short circulating half-life IFN-alpha is administered to patientsby daily or thrice weekly injection for optimal effectiveness. Recombinant consensus interferon mutant I (IFN-Con-m2 , IIFNm2) was a mutant from IFN-Con with a free cysteine residues at position 86. The protein could bemodified with a 2 kDa maleimide PEG and the mono-PEGylated proteins were purified by CM Sepharose FastFlow column chromalography. Mono-PEGylated IIFNm2 could be separated from muli-PEGylated IIFNm2 andunmodified IIFNm2 by stepwise elution. After purifcation, the purity of mono-PEC-IIFNm2 was up to 98% , andthe biological activity was more than 5. 0 x 1061U/mg. The test of anti-typsin digestion suggested that PECylationcould improve the ability of avoiding the trypsin digestion. Pha中国煤化Its demonstraled thatthe circulating half-life of the PEGylated protein was up to 1;YHC N M H GIFNm2. These datacould demonstrate the utility of site- specific PEGylation for creating highly potent, long-acting IIFNm2.Key words Consensus interferon mutant Site-Specific Pegylated Pharmacokinetic Circulating half-life