聚乙二醇(PEG)对杜仲胚乳愈伤组织茎芽分化的影响

西北植物学报2001,21(6):1142- 1146Acta Bot. Boreal. -Occident. Sin.文章编号:1000-4025- (2001)06- 1142-05聚乙二醇(PEG)对杜仲胚乳愈伤组织茎芽分化的影响朱登云,蒋金火,田慧琴,李浚明(中国农业大学生物学院,北京100094)商要:实验中发现,在培养基中加入适量PEG可以显著提高杜仲胚乳愈伤组织分化频率。PEG这种促进分化的效果既与PEG的分子量和所用的浓度有关,也与培养基中无机离子的.强度和蔗糖浓度有关。效果最佳的培养基配方是:在激素组成为BA(2.0~2.75 mg/L)+NAA 0. 15 mg/L)的基本培养基(MS无机盐+Bs有机物+ 3%蔗糖)中,添加浓度为4%~6%PEG4000或4%~5%PEG6000。在这种培养基上杜仲胚乳愈伤组织的分化频率均超过50%，最高可达70%以上,而在同样的条件下不加PEG时分化频率不到10%。然而,经PEG处理分化出来的胚乳再生植株中,部分苗玻璃化现象严重。关键词:杜仲;聚乙二醇;愈伤组织分化中图分类号:Q943.35文献标识码:AThe effect of polyethylene glycol (PEG) on shoot redifferen-tiation of endosperm-derived callus in Eucommia ulmoidesZHU Deng- yun,JIANG Jin-huo,TIAN Hui-qin,LI Jun- ming(College of Biological Science ,China Agricultural University ，Beijing 100094 ,China)Abstract:It was found in the present study that redifferentiation frequency of callus inE. ulmoides could be raised remarkably by adding an appropriate concentration of PEG inthe basal medium. In doing so,what's worth particular attention was as follows:the ef-fect of PEG on promoting shoot redifferentiation was closely related to the molecularweight of PEG ,and the concentration o中国煤化工was also related to thestrength of inorganic ions ,and the conce:TYHCNMHGmedium. The most ef-fective recipe of basal medium was MS inorganic salt十Bs organic supplements + 3% su-crose ,with phytohormones being BA (2. 0~2.75 mg/L)+NAA (0. 15 mg/L) and with。收稿日期2994-21;修改稿收到日期:2001-08-12基金项自?国家然科学基金资助项目的-部分(39570463)。作者简介:朱登云(1962- ),男(汉族),副教授,博士。6期朱登云等:聚乙二醇(PEG)对杜仲胚乳愈伤组织茎芽分化的影响11434%~6% PEG 4 000 or 4%~5% PEG 6 000 added in. In such a medium,over 50% ofshoot redifferentiation frequency was achieved , while under the same condition exceptfor the absence of PEG,the frequency turned out to be less than 10%. Unfortunately,many of shoots redifferentiation on the PEG-containing medium suffered from vitrifica-tion,the solution to which is under our investigation.Key words : Eucommia ulmoides ;polyethylene glycol (PEG) ;shoot redifferentiation杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)是我国特有的经济林树种，也是最具开发前景的温带胶源植物。其树皮、树叶、果实所含的杜仲胶具有广阔的工业开发前景1。然而,由于作为主要提胶器官的叶片含胶量低,直接限制了杜仲胶的开发利用。因此,通过遗传改良以提高杜仲单株产叶量及叶片含胶量已成为当务之急。胚乳培养是建立杜仲三倍体新类型的一条值得探索的育种途径2。迄今为止,虽然由杜仲成熟干胚乳和未成熟胚乳培养都已获得完整再生植株,并已移栽成活[2.3]。但胚乳愈伤组织分化频率低,特别是正常苗的分化频率极低(0.01%~0.1%),且分化所需时间长。因此,如何提高胚乳愈伤组织的分化频率,缩短分化所需时间,以获得数量较多且倍性稳定的胚乳再生植株,是杜仲三倍体育种中亟待解决的问题。研究发现,在培养基中加入适量的聚乙二醇(PEG)可以显著提高杜仲胚乳愈伤组织的分化频率。PEG是一种惰性的高分子聚合物,分子式为HOCH2(CH2 OCH2)nCH2OH。聚合程.度不同,则分子量也不同。在组织培养中应用较多的是PEG 4 000和PEG 6 000;与一些小分子渗压剂如蔗糖和甘露醇相比,PEG的最大特点是本身不能穿越细胞壁进入细胞质,因而不会引起质壁分离,使植物组织和细胞处于类似干旱的水分胁迫之中4]。PEG的这一特性被广泛应用于植物组织培养的若干领域,如抗旱突变体的筛选[5]、通过对外植体的预处理以提高愈伤组织诱导频率[6.7]、促进愈伤组织生长[8]、促进胚状体的发生和成熟[9~13],以及提高试管苗移栽成活率[14~16]等。但利用PEG促进愈伤组织不定芽分化的研.究还未见报道。1材料与方法1.1材料杜仲成熟干胚乳愈伤组织,其来源见朱登云等以前的报道[2]。中国煤化工1.2培养基与培养条件所用的基本培养基(BM)为MS无MYHCN M H Gp酵母浸提物(YE)800mg/L和蔗糖30 g/L,用琼脂7 g/L固化,在高温灭菌前将pH调至5.8。培养条件:培养室温度25C士2C ,光照时间16 h/d,光照强度1 000~1 500 lx。1.3愈伤组绢鲍翁化将愈伤组织培养于补加BA(1.2 mg/L)和NAA(O.15 mg/L)的基本培养基中继代1144西北植物学抵21卷增殖21 d后，再将其切成小块,转接到含有BA(2. 0~2.75 mg/L)和NAA(0.15 mg/L)以及不同浓度PEG的培养基上。每项处理接种愈伤组织98~256块,30d后统计各处理愈伤组织的分化频率。2结果鉴于培养基的渗透压是影响愈伤组织生长和分化的重要因素之一。在实验初期,为了通过增加渗透压以达到提高分化频率的目的，曾在激素组成为BA(2. 0~2.75 mg/L)和NAA(O.15 mg/L),蔗糖浓度为3%的分化培养基中再添加3%~9%的葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇等小分子渗压剂以及提高培养基中的琼脂浓度,但皆无助于分化频率的提高。特别是添加甘露醇或山梨醇后,愈伤组织的生长受到严重抑制,导致大量愈伤褐化死亡。然而,在进一步的实验中却发现,在激素组成不变的情况下,添加一定浓度的PEG,可使分化频率由原来的不足10%骤增到70%以上(图1);但PEG的这种促进分化的作用受以下几个因素的影响。。对照(CK)PEG处理(PEG treatment )图1分化培养基中添加6%PEG4000后显著提高了杜仲胚乳愈伤组织的分化频率Fig. 1 The redifferentiation frequency of endosperm- derived callus in E. ulmoidesraised remarkably by adding 6% PEG 4 000 in the redifferentiation medium2.1PEG浓度和分子量对其促进分化作用的影响PEG促进茎芽分化的效果与培养基中国煤化工有关。浓度过低,效果不YHCNMHG明显;浓度过高,引起培养基不凝固并造n..nn。PEG 6 000的浓度超过6%或PEG4000的浓度超过10%时,培养基就不能凝固。图2表示在BM+BA(2.0mg/L)+NAA(0.15mg/L)的培养基中添加不同浓度和不同分子量的PEG对分化频率的影响。在相同朐激秦组合中,未加PEG的培养基中分化频率不超过6%(未包括在图2内)。6期朱登云等:聚乙二醇(PEG)对杜仲胚乳愈伤组织茎芽分化的影响.114520006000ol40007.8PEG%图2PEG的浓度和分子量对杜仲胚乳愈伤组织分化频率的影响Fig.2 The effect of concentration and the molecular weight of PEG on redifferentiationof endosperm- derived callus in E. ulmoides由图2可看出,PEG在2.0%~7.5%的浓度范围内,PEG 4 000和PEG 6 000的效果明显优于PEG 2 000。培养基中添加浓度为4. 0%~6.0%的PEG 4 000 或浓度为4.0%~5.0%的PEG 6 000效果最好,分化频率均高于50%,最高可达70%~80%,且同一块愈伤组织上出现1个以上茎芽分化。2.2培养基中无机离子强度和培养基中蔗糖浓度对PEG促进分化效果的影响表1所列结果表明,PEG促进胚乳愈伤组织分化的效果与培养基中无机离子强度和蔗糖浓度有一定的关系。降低基本培养基中的无机离子强度或提高其中的蔗糖浓度,则PEG促进分化的效果亦随之下降。表1培养基中无机离子强度和蔗糖浓度对PEG效果的影响'Table 1 The influence of the strength of inorganic ions and the concentrationof sucrose in the medium on PEG effect茎芽分化数愈伤分化频率%.处理愈伤组织数No. ofRedifferentiationTreatmentsNo. of calliredifferentiationfrequency %3/4MS无机盐+Bs有机物+3%蔗糖3/4 MS inorganic salts + B: organic compo-985556. 1nents十3% sucrose1/2MS无机盐+Bs有机物+3%蔗糖1/2 MS inorganie salts + Bs organic compo-33. 7中国煤化工BM+3%蔗糖(对照)65.3BM+ 3% sucrose (control)MYHCNMHGBM+ 4%蔗糖BM+ 4% sucrose3232.7BM+5%蔗糖BM+5%sucrose!821.4*激素组成:BA(2.75 mg/L)+NAA(O.15 mg/L),添加5% PEG 4 000。综上秀绣凝飲实验结果证实,PEG确有促进杜仲胚乳愈伤组织分化的效果,尤其是当以MS无机盐+B。有机物+3.0%蔗糖为基本培养基、激素组成为BA(2. 0~1146西北植物学抵21卷2.75 mg/L)+NAA(0. 15 mg/L),添加4.0%~6.0% PEG 4 000或4.0%~5.0% PEG6 000的效果最显著,分化频率均高于50%,最高可达70%以上。然而,经PEG处理分化出来的胚乳再生植株中,部分苗玻璃化现象严重,这-问题正在进一步研究之中。3.讨论PEG作为一种高分子渗压剂，会对愈伤组织细胞的生长和分化产生深刻的影响。在本研究中,PEG不仅具有促进分化的作用,而且还能刺激细胞生长,使愈伤组织生长速度加快,并改善其状态。这与Bressan等8]在番茄组织培养研究中报道的结果相似。但同为渗压剂的甘露醇、山梨醇等表现为对愈伤组织强烈的抑制作用,并造成愈伤组织大量死亡。造成这种现象的原因,目前还不清楚。另据报道,在一些裸子植物中,PEG是通过改变培养基的水势,使培养物处于水分胁迫状态来促进胚状体的成熟,而且用其它小分子渗压剂如蔗糖、甘露醇等或外源ABA代替PEG,也具有这种效果[17~19]。但在我们的研究中发现,无论添加外源ABA或添加低分子渗压剂都不能提高分化频率。可见PEG促进愈伤组织分化和促进胚状体成熟的机制不同,这一问题有待进一步研究。参考文献:[1] 严瑞芳.杜仲胶研究新进展[].化学通报,1991,47;1-6.[2]朱登云,蔣金火,裴德清,等.由杜仲成熟干种子胚乳培养再生完整植株[].科学通报,1997,42(5):560-561.[3]朱登云,蒋金火,田慧琴.等.杜仲未成熟胚乳愈伤组织的诱导和植株再生[J].中国学术期刊文摘，1998.4(3);381-382.[4] ATREE S M.FOWKE L C. 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