RNA干扰技术的应用

第25卷第4期大连医科大学学报2003年12月Journal of Dalian Medical UniversityRNA干扰技术的应用赵洪波,张嘉宁大连医科大学生物化学教研室辽宁大连116027)摘要RNA干菰 RNA interference rnai是与靶基因序列同源的双链RNA诱导的一种特异性的转录后基因沉默现象。目前RNAi的作用机制已经基本明确并显示了广阔的应用前景。RNAi技术作为新的基因阻断技术已经成功地应用于人类基因组功能的研究同时提供了一条人类抗病毒治疗的新技术。另外借助RNAi技术还有望在将来于基因水平对肿瘤进行治疗。关键词 RNAi siRNA基因沉默中图分类号Q522文献标识码A文章编号】671-72952003)4-0293-031998年Fire与Mll将与内源性mRNA序列平端的 SiRNA不具有RNAi的功能5。同源的双链RNA( dsRNA)导入细胞时,发现dsRBernstein等率先成功地对参与第一步反应的NA能高效地降解该mRNA从而导致该基因表达核酸内切酶进行了提取与分析,将之命名为的沉默池他们将此现象命名为RNA干扰现象1。Dc3研究发现,icr是RNae家族中的一在随后的研究中发现RNAi广泛存在于生物界中,员。它含有一个螺旋酶结构域,一个PAz(prin如果蝇2拟南芥菜3及哺乳动物4]等。RNAi与wgonad- wille)结构域两个 RNaseⅢ催化真菌的共抑制 quelling)及植物中转录后基因沉默域及 dsRNA结合结构域 dsRBD) Dicer通过PAZ(post- transcriptional gene silencing PTGs存在着结构域与其他相关蛋白的PAZ结构域结合形成多非常相似的基因沉默机制。故推涧,RNAi是不同亚单元复合物特异性地将dRNA切割为21~23生物体普遍存在的从RNA水平调节基因表达的方nt的siNA。需要注意的是编码Dcer的 Dicer式代表了一种古老的生物途径基因属于进化保守基因。因此线虫、果蝇、哺乳动物RNAi作用的机制等不同种属生物的 Dicer结构与功能均很相似这可能是RNA是生物体一种进化保守机制的结构基RNAi的作用过程分三个步骤(1羧长的dsR-础。参与第三步反应的酶,目前认为,是一种与NA被RNA核酸内切酶加工成21-23-nt的小干Dcer不同的核酸酶 RNase),至于这种核酸酶如何扰 RNA Small/ short interfering RNA SiRNA)(2)将靶mRNA特异性地降解机理仍有待于进一步研SIRNA与核酸诱导的沉默复合物(RNA- induced究。silencing complex riSC)合。(3)合物中的siRDicer除了参与RNAi外还能将70-nt左右NA中的原义链与对应的同源mRNA交换原义链茎环状结构的RNA切割为22-nt左右的片段。由解离出来mRNA定位在原来原义链位置进而被于这些片段只能在特定的阶段和时间内表达故称降解。 SIRNA是RNAi的中心环节;它由两条21之为小时序RNA( mall temporal RNA, SiRNA核苷酸(nt舶单链组成其中有19-nt形成双链;stR中国煤化工-7。它们不编码蛋白两条链3′端各有2-nt的对称性突出。这种对称性质CNMH的重要调节因子突出对于 SiRNA的功能是非常必要的。研究表明些sN八习siNA介导的基因沉收稿日期2003-04-14修回日期2003-05-20*作者简介赵洪波1977-)女朝阳人硕士研究生*基金项目国家自然科学基金项目序号396000110大连医科大学学报第25卷默过程有潜在的联系6。3RNAi技术在抗病毒治疗上的应用2RNAi技术在基因功能研究中的应用目前已经证实植物中的转录后基因沉默能够RNAi能够在多种生物中被用来灭活特异序列抵抗病毒感染Ⅲ。这可能是植物的一个本能的反的基因产生类似基因被剔除”的效应。它与传统应是植物在长期进化过程中为了保护自身基因组的基因剔除技术相比具有投入少、周期短、操作简单完整性抵御外来核酸入侵一种防卫保护机制。这等优势。RNAi技术已经作为一种新型的反向遗传种机制可能在其他生物中也存在。学技术成为基因功能研究的重要工具。在基因的SiRNA介导的RNAi能够提高人体细胞与小鼠研究中首先利用此技术剔除待研究的目标基因然细胞对病毒的免疫水平已经由 Gitlin等证实12。后通过细胞表型改变的观察、免疫蛋白印迹、免疫荧他们将人与小鼠的细胞事先用sRNA加以处理发光等方法即可对基因的表达及功能进行分析。Har-现这些细胞能显著抑制脊髓灰质炎病毒的增殖,对borth等利用RNAi技术对21个在亚细胞水平定位病毒的清除能力也大大提高。当然这种抗病毒作用和功能不同的基因进行了研究η并根据特异性基也是序列特异性的。实验中他们发现 SIRNA所靶因沉默后细胞生长情况将所研究的基因分为细胞向的mRNA特定的基因片段即使只有一个核酸的必须基因和细胞非必须基因。迄今为止,RNAi技改变也会导致RNA的失败充分说明了这种抗病术在真菌、植物、线虫、果蝇及哺乳动物的基因功能毒作用的序列特异性洏而不是其他抗病毒系统或干研究中发挥了重要的作用,利用此技术成功地对许扰素的作用。多哺乳动物的基因进行了分柝6。Bike等利用RNAi技术对呼吸道合胞病毒最近在哺乳动物的研究中发现只有3′端对称(RSⅴ璂因成功地进行了抑制汯到了抑制病毒感突出2-nt的约21-nt的siNA才能对靶基因产染的目的13但他们也发现要完全扣制RSV病生特异的沉默效应。当 SiRNA的长度大于30-nt毒基因的表达很难做到。他们推测RSV病毒基因时由于激发了dRNA依赖的蛋白激酶和干扰素系组上可能附着了某些蛋白成分,它与核酸形成较大统其基因沉默效应是广泛且非特异的。因此要对的复合物,使 SIRNA与mRNA难以很好的接近。某一序列基因进行特异的基因沉默必须将21- nt Jacque等则开展了利用RNA对HV-1复制进行左右的 SiRNA直接导入哺乳动物细胞中。它涉及调控方面的研究141利用 SiRNA来靶向HV-1基两个关键的环节:首先,如何合成 SiRNA。自从因可以引起HV-1复制过程的抑制从而抑制病RNAi发现以来人们便开始尝试各种合成方法最毒的繁殖。这项研究开辟了治疗艾滋病的新途径。初多采用化学合成法但这种方法成本很高且操作虽然最近有许多关于RNAi成功抑制病毒感染复杂。目前已有研究组利用T7噬菌体聚合酿(T7的报道但要将RNAi最终应用于人体抗病毒治疗phage polymerase法成功进行了siNA细胞内合中似乎还有很长的一段路要走许多问题还有待于成8]利用T7噬菌体聚合酶分别合成 SiRNA的原深入的研究。首先植物实验中RNAi介导的抗病链和反义链两段RNA在细胞內退火连接成siR-毒反应中,植物体内的病毒会产生各种各样的NA。这种方法较化学合成法更为经济简便同时还RNAi抑制剂不同的抑制剂会作用于RNA不同的克服了RNA不稳定易降解的弊端。 Miyagishi等环节最终都会导致RNAi介导的抗病毒作用的失建立的U6启动子方法与此方法类似9其次如败。哺乳动物体内的病毒能否产生与植物体内病毒何将 SiRNA转导入细胞内。目前应用比较多的是类似的扣制剂这对RNAi的抗病毒治疗的应用致阳离子的脂类载体因其具有毒性小且不易与细胞关重要这一问题至今尚没有较深入的报道。其次,发生融合的优点但根据所应用的细胞类型不同非目前对RNAi介导的抗病毒治疗研究主要是在动物阳离子的脂类载体也是可取的。由于不同的载体有模型晋克注射到动物体内,它可不同的细胞特异性所以对于某一特定的细胞载体以在中国煤化富集的 SiRNA浓度不的选择应该是十分谨慎的。 McManus等利用电击同CNMHG毒基因沉默效应。但穿孔法将 SiRNA导入到细胞中101其优点是导入要将此技术应用于人体则必须找出一种高效且安率很高达到95%以上但细胞在导入过程的死亡全的 SiRNA的递送方法使 SiRNA只能对病毒的靶率高达50%。尽管各个研究组所采用的合成导入基因进行基因沉默发挥高效的抗病毒作用而不对方法各异但均取得了明显的基因沉默效应。人体正常的基因或组织造成损害。随着研究的深第4期赵洪波等RNA干扰技术的应用入相信终有一天这项技术会被应用于人类抗病毒[3] Wassenegger M, Pelissier T. A model for RNA- mediated的治疗。gene silencing in higher plant[ J ] Plant Mol Biol, 199837349-3624RNAi技术在肿瘤基因治疗方面的研究进展4 ]Sayda ME Jens h winfried L et al Duplexes of 21-nuide rnas mediate rna interference in all cultured由于RNAi能够在哺乳动物系统中被用来灭活mammalian celly J Nature 2001 A11 494-498特异序列的基因片段许多学者便考虑凭借此技术[5] Nykanen A, Haley b, Zaire pd. ATP requirements and在基因水平上对肿瘤进行治疗。但借助RNAi在基small interfering RNA structure in the RNA interference因水平上治疗肿瘤并非只对单个癌基因进行敲除就thway[ J]cll2001107309-32能达到。肿瘤是一种多基因遗传病是多个基因相[6 Michael T, McManus Phillip As Gene silencing in mammals by small interfering RNA J ] Nature Reviews Genet互作用形成的基因网络调控的结果单个癌基因的ics20023:737-747阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长而目前利[7] Harborth J, Elbashir SM, Bechert K,etal. Indentification用RNAi技术对于两个或多个基因同时敲除的研究of essential genes in cultured mammalian cells using small仍需深入。 Elbashir等成功将Hela细胞(美国黑人erfering rna[ J]. Cell Sci 2001 114 4557-456编码核有丝蛋白核纤蛋白的基因同[81 YuJY DeRuiter SI.umrD, RNA interference by ex时敲除15。 McManus等开展了对T细胞的CD4mammalian cell[ J ] Proc Natl Acad Sci USA, 200299和(D8同时敲除的实验10。他们发现同时对CD46047-6052和CD8敲除实际意义不大因为用来敲除Cm4的[9] Miyagishi M, Taira K.U6 promoter- driven siRNA withiNA会与用来敲除CD8的 SiRNA产生竞争性抑four uridine 3 overhangs efficiently surpress targeted gene制。尽管如此RNAi技术还是为胂瘤的基因治疗expression in mammalian cell[ J ] Nat Biotech 2002, 19提供了一条新的思路。[10 ]McManus MT Haines BB Chen J, et al. siRNA- mediat5结语ncing in T-cells. J Immunol in the press11 ]David B RNA silencing "Diced defence J Nature .2001RNA干扰技术作为一种新的基因阻断技术方409295-298兴未艾已经成为人类基因功能研究的得力工具同[12 I Gitlin L, Karelsky. Andino R. Short interfering RNA时它的应用也为人类早日攻克病毒感染性疾病以及confers intracellular antiviral immunity in hu[J] Nature2002A18:30-434肿瘤等提供了新的技术手段。相信随着相关技术的[13 J Bitko V, Barik S, Phenotypic silencing of cytoplasmic成熟,它必能为人类疾病的治疗作出贡献。genes using sequence-specific double- stranded short参考文献interfering RNA and its application in the reverse genetcs of wild type negative- strand RNA viruses[ JI ]Fire A, Xu S, Montgmery MK, et al. Potent and specifiBMC Microbiol 2001 1 34-37genetic interference by double- stranded RNA in 14 Jacque JM, Triques K Stevenson M. Modulation of HIVCaenorhabditis elegan[ J ] Nature 1998 806-811I replication by RNA inference[ J ]. Nature 2002[2 Berstein E, Caudy A, Hammond SM, et al. Role for a418435-438bidentate ribonuclease in the initiation step of RNa inter-15 ]Elbashir SM Harborth J Weber K ,et al. Analysis of geneference J ] Nature 2001 409 363-366function in somatic mammalian cells using small interfer-RNAs[J] Methods 2(Application of RNa interference technologyZHAO Hong-bo, ZHANG Jia-ningDepartment of Biochemistry Dalian Medical University Dalian 116027, ChinaAbstract: In 1998, Fire and Mello described a new technology they called RNA interference RNAi ). RNAi is anew technology that is based on the silencing of specific genes中国煤化工 dSRNA) Now investigaters are not only using RNai to elucidate gene function in mCNMHGdevelop antiviral therapeutics this review provides a general outlook on the application of rnaiKey words: RNAi sirNA gene silencing