丹宁-聚乙二醇法提取纤维素酶的研究

第27誊第8期吴麓清等:丹宁_秦乙二醇法提取纤维岽酶的研究4:丹宁_聚乙二醇法提取纤维素酶的研究吴慧清黄小茉李剑英吴清平(广东省微生物研究所,广州, 510070)摘要木幕经圃态发醇剿成纤维素霹湿曲,按曲水体积比1:5加入40汇去离子水,保温60min后,过滤获得粗纤维素瞬液。在廊话为FPasee 22.6w/mL的稀酶液中,加入丹宁至5.0g/L时,粗解液中纤维素酶接近完全沉淀下来,将沉淀分敝于pH4.6的0.1mol/L柠襟酸绠冲液中,加入分子质量为6000u的聚乙二醇(PEG)至丹宁含量的1.6-4.0倍,障活回收率达到210%~245%，可将纤维素獬浓缩7~8倍。PEG对纤维素酶有教活作用,采用丹宁作为纤维素脾的沉淀剂,PEG可将纤维素睥从酶~丹宁复合物中解析出来。丹宁、PEG的用量与降液中的蛋白质含量有关,PEG超过解析酶用量的一定范围,因熬合纤维素廨使酶活回收率超过100%,过多PEG会使系统发生相改变,从而使降失活,使得霹活回收率急剧降低。关键词纤维素酶丹宁藁乙二醇提取法丹宁是一种多酚类物质!"),能与蛋白质丹宁酸(简称丹宁):分析纯,中国遵义市结合生成不落于水的复合物。在找到一种将第二化工厂,贵州;聚乙二醇(PEG):分子质酶或蛋白质从这种复合物中解析出来的方法量8000 u、6000u,进口分装;羧甲基纤维素以前,丹宁对酶来说是一种失活剂。因此丹钠(CMC):上海长虹塑料厂产品，粘度(pH .宁沉淀法作为酶的提取方法，- -直未能获得6.1)0.3~0.6Pa.s; 滤纸:新华1号定性滤大规模的工业应用。后来,人们找到了几种纸;纤维素酶曲:木霉菌种,经固态发酵制成。将酶从丹宁与酶的复合物中解析出来的物1.2 纤维素酶活力的测定质,这些物质主要为聚乙二醇(PEG)、聚乙烯纤维素酶活力单位定义为:60 min水解氮戊酮(PVP)、聚氧化乙烯或山梨糖醇的甘生成1 mg葡萄糖的酶量为1个活力单位。油油酸酶(POE.S. M0)或硬脂酸(POE.S.1.2.1羧甲基纤维素 酶(CMCase)活力测MS)[2],这为丹宁沉淀法的工业应用开辟道定[12,13]路。用丹宁沉淀法制备的酶制剂不含盐,纯取待测稀释酶液0.5 mL,加入5g/L度高,不但符合食用的要求,而且可以作为口CMC溶液1.5mL,50七酶解30min,加入3服药用廊制剂[3),亦可用于纺织加工和发酵mL DNS试剂(43],佛水浴10min,在波长530工业等[4~9]。迄今为止,丹宁沉淀法已用于nm比色测定还原糖的含量。a-淀粉酶、酸性蛋白酶、糖化酶、脂肪酶、果胶. 1.2.2 滤纸耪酶(FPase)活力测定[4,5]酶等水解酶的提取,但酶活损失大[3.10]。本.1 mL稀释的待测酶液，加入0.05 mol/L研究在利用丹宁沉淀纤维素酶后,采用聚乙pH4.6的柠檬酸缓冲液1mL和1条1cmX6二酵解析和激活纤维素酶,可以有效地提取cm新华 1号滤纸, 50C酶解60 min,加入3粗酶液中的纤维素酶。mLDNS试剂,沸水浴10min,在波长530nm比色测定还原糖的含量,扣除空白后计算酶1材料和方法活力。1.1材料1.3制备浓缩液态纤维素酶制剂的工艺过第一作者:硕士,工程种。收藕时间:2000- 11 - 20,改回时间2001 -04-06中国煤化工MYHCNMHG42食品与发酵工业Food and Fermentation Industries Vol.27 No.82.2丹宁酸对纤维素酶的沉淀作用将固态的纤维素酶浸提液经压榨或离心取6份100mL经浸提离心后FPase为制得粗酶液,加丹宁酸将酶沉淀下来,离心，22.6u/mL的稀酶液，按稀酶液量加入1.0,弃去上清液,将沉淀用介质将其分散,加入适2.0,3.0,4.0及5.0g/L的丹宁酸，搅拌后,量的解析剂,搅拌均匀,作用-定时间后,离在室温下放置3h,离心，收集上清液和沉淀心,收集上清液,加防腐剂、稳定剂，制得浓缩物,测量上清液中的酶活力。结果表明,当丹液体酶制剂。宁加量达到5.0 g/L时,粗酶液中纤维素酶几乎可以完全沉淀下来(表2)。2实验结果喪2丹宁加对纤绪素制沉淀的影响2.1纤维素酶浸提工艺参数测定 .丹宁加量/L- 01.0 2.0 3.0_ 4.0 5.0称取120g含水量在500~ 700 g/kg纤上清被酶活.8 13.5 6.3 2.5 0.5 0.0曲3份,分别按曲水体积比为1:3、1:5、1:7Pse/u*mL.-I加入40C无离子水,于40七水浴中保温602.3解析过程中介质的选择min,另取同量的湿曲，按1:5的比例加入室在解析实验中选择pH4.6的0.1 mol/L温下(16C )的冷水，于室温下提取60 min,作柠檬酸缓冲液、纯水、0.1 mol/L碳酸钠溶液为对照。选择1:5的曲水比,40C提酶温度作为分散介质。结果表明:(1)以pH4.6的做为提酶工艺参数(表1)。若提酶材料为干0.1 mol/L柠楝酸缦冲溶液和纯水为分散介曲粉,则应加大水与曲的比例1:9~10。质效果较好,说明了酶解析试验适合在中性表1不同加水比例和浸提温度对提酗 效果的影响和弱酸性介质中进行。(2)聚乙二醇的分子曲水体职比:31:51:授提温度/心401质量为6000~ 8000 u,对酶解析试验中的酶压祚后酶体积/mL.9050880 65得率影响不大(表3)。.FPe/u"mL-I20.44 13.99 10.99 11.42.4聚乙二酵对纤维素酶沉淀的解析作用总FPae/u7971.6 9093.5 9671.2 7410.0取6份550mLFPase为22.6u/mL的过程撅失Pe/so-812.5 +309.4 +887.1 -137.4FPae损失/x10~-9.3 +3.5 +10.09 -15.6稀酶液,加入5.0g/L丹宁,搅拌,离心后,将注: 120g曲总FPRs为8784.1u。.获得的沉淀物用分散介质分散,按稀酶液量加入1~8g/L分子质量为6000u的PEG,赛3分散介质对酶解析的影响丹宁加量PEG分子PEG加t分散介质酶液总体积侬墉酶液酶活力/g.L"1质量/u/g.L-1(酸、碱依度0.1 mo/L)/mL_FPase/u. ml" 18000柠楝酸鹱冲液01156000柠據胶缦冲榷02155拧檩胶媛冲液001918碳酸钠溶液搅拌,于冰箱中放置过夜,离心,收集上清酶体纤维素酶,加质量百分含量为0. 5%的丹液,测定其FP酶活力。试验表明随着PEG宁于4C冰箱过夜沉淀,于10000r/min, 4C用量的增加,浓缩酶液中酶活增加,并且具有冷冻离心10 min,收集沉淀,加4 mL纯水分-种较强的激活趋势(表4,图1)。散,加不同量PEG6000于4C冰箱解析过2.5增加 PEG用北对纤维素酶解析效果的夜,第2天采用转速10000 r/min, 4C冷冻影响.离心10min,收集浓缩液并补充纯水至体积取10份40mLFPase为38.0u/mL液均为7.5mL,测量FPase酶活。中国煤化工HCNMH G第27卷第8期吴慧清等;丹宁.秦乙二醇法提取纤维隶酶的研究43表4解析剂聚乙二醉用量对纤维素酶解析效果8PEG加量/g:L10廊液体积/ml507477.酶活力/um156.0203.0219.8258.7391.3总FPese/u2430748111 5441502216 2651914328 956FPsxe 损失事/X 10-2-39.8-7.13+20.8+ 30.8+54.0+ 132.9酶活得事/x10~260.192.9120.8130.8154.0232.9依编倍数/倍_7.47.4出某一数值(本试验中为1:4)时,纤维素酶的回收率急剧降低(表5,图2)。年150r00 ts 200PEG的用量/gL'100图1 PEG 对丹宁酶复合物的解析效果试验表明,当PEG和丹宁的比值在-PEG和amion的比值定范围内增加时,纤维素酶的回收率增大,超图2增加PEG对PEG-丹宁的解析效果裹5增加PEC对纤维素酶的解析效果PEG: tnnin1:11:1.61:3:41:FPrse/u*mL-11718814426172143112总FPse/u13351410235515912901072.584冀活得率/%87.392.8154.9210.255.32.6 PEG 对纤维素酶的激活作用2.7丹宁用和PEG用的相关性取6份10 mL FPase为38.0u/mL的液体取800 mL FPase 为22.6 u/mL的稀释纤维素酶，分别加入0,0.25,0.5.1.0和3.0%酶液 4份,分别加4,5,6,8g/L的丹宁(按稀PEG6000(w/ v)测定其酶活(结果见表6)。释酶液体积比加),搅拌并离心后,获得的沉表6 PEG 对纤维素酶的激活作用淀物在分散介质中再加与丹宁等量的PEG/90.25 0.5 1.0 3.0PEG6000解析,另外,取3份550 mL上述稀FPse3844.8 50.1 50.3 50.8酶液,加丹宁至5g/L搅拌离心后，获得的沉/u.mL" 1淀物在分散介质中再分别加4、5、8g/L的数据分析:几次实验数据之间有一些差PEG6000解析,离心后，收集上清酶液,并测异,这是由于用于提酶的纤维素酶原液其蛋定其FPase活力。白含量不一致。丹宁、PEG和蛋白质含量之表5结果表明,同样的稀酶液,用相同的间应还存在一种相关性,即蛋白质含量大,用丹宁沉淀,不同量的PEG解析,随着PEG的于解析的PEG需要的越多。PEG 在一定浓用量增加,得率也增大。另外,丹宁增加，度范围内可激活纤维素酶,但溶液中的PEGPEG不变时,酶的得率减少，因此PEG用量含量太多时会使系统发生变化,使酶失活。和丹宁用量之间存在- - 种相关性。中国煤化工MHCNMHG444食品与发酵工业Food and Fermentation IndustriesVol.27 No.8表7丹宁用和PEG用的相关性丹宁加量PEG加量依酶掖体积_ 依廊液腾活/umL1 总 FPase酶活得率 依编倍数 原始廊液/g*L-1/g*L~1/mL_CMCaseFPase/u_1f/mL99174427420248.5177.11753317880800257104211166259.724602136x931 600303.8300766611 480156.812230985512 376219.817144385507818900391.3。30521注:稀腾液的房活，FPue 22.6u/mL,体积800mL,总FPase为18080 uo若体积为550 mL,总FPase为12 430 uo参考文献3讨论1邱嫣巴洛夫T.K.著,徐德祥译.植物鞣质化学基础(25).北京;科学出版社, 1960丹宁提取法用于制备纤维素酶制剂既浓2小林时夫. 日特公昭41 - 7833, 1966缩了酶液，同时,在提取过程中不但没有损失3张树政主编.酶制剂工业.北京:科学出版酶活,反而能徼活酶活。聚乙二醇既是解析社, 19844顾贷芳,卞殿明. 食品科学, 1998, 19(7):27剂,同时也是酶的激活剂。该法比盐析法简~305 Capek P etal. Int. J. Biol. Macromolecules,单,得率更高,且不含盐,不用经脱盐处理。1995, 17(6),337~40因此,应用此法制备纤维素酶较盐析法有效。6 Kobayashi T et al . Macromolecules, 1996, 29丹宁沉淀法中丹宁用量,受酶液中蛋白(7),2698 ~2700质含量、种类及pH等因素的影响,试验时应7林开江,阮丽娟.王农英.生物技术。1996,6(3):45~48当根据实际测绘的沉淀曲线来决定其添加8贺志勇.印染, 1992, 18(3):40~42量。此外,利用丹宁沉淀纤维素酶,采用秦乙9庄梅芳,宗复.印染，1993, 19(5):22~2510 陈驹声主编,胡学智编.酶制剂生产技术,二醇做解析剂的酶浓缩法,也有美中不足之北京:化学工业出版社.1994处。聚乙二醇将酶从丹宁-酶复合物中置换11张海,冯成刊等. 标准化报道, 1995, 16出来时，生成树脂状的复合物,附着在容器壁(4):37~38,44? Mandels M et al. Biotechnol. Bioeng.上,较难除去,虽可用洗洁精或酒精洗涤,但Symo. , 1976, (6):17如果能找到- -种解析剂避免形成这种树脂状13蒋传葵等.工具酶活力测定. 上海:上海科学出版社, 1982. 82~87的物质,将会更好。Cellulase Extraction Using Tannin-PEG MethodWu Huiqing Huang Xiaomo Li Jianying Wu Qingping( Guangdong Institute of Microbiology, Guangzhou, 510070)ABSTRACT Cellulase was extracted from the solid state culture medium in which a strain ofTrichoderma was grown. After the culture medium was steeped in 40C ion-free water for 60minutes , the crude cellulase liquid was made by filtering the steeper, when the content of tanninin the enzyme liquid up to 5.0 g/L and the enzyme - tannin compound was dispersed in pH 4.6citrate buffer, cellulase could be liberated by putting PEG 6000 into the suspension, the enzymerecovery rate reached 245 percentage and the ellulase was concentrated 7~ 8 times. The experi-mental results proved that PEG had an activation to cellulase , if tannin was used as a precipitatorduring cellulase extraction, PEG could liberate the enzyme from the enzyme - tannin compound .The content needed of tannin and PEG was relative to the protein quantity in the liquor . Whenthe content of PEG exceeded the amount needed to liberate the enzyme, to some extent, the cel-lulase could be activated. If PEG s amount was too much it would make cellulase inactivated be-cause the system had been changed.Key words cllulase, tannin, polyethylene glycol, extraction method中国煤化工HCNMHG