RNAi技术的应用

遗传繁育中国畜牧兽医2007年第34卷第2期RNAi技术的应用王军张以芳张晔云南农业大学动物科学与技术学院昆明650201)摘要将双链RNA导入细胞內会引起与其同源的基因的沉默这种现象称为RNA干扰( rNA interference rNai)〉作者从RNAi技术的历史、作用机制、应用以及前景4个方面其中主要就其应用方面的研究作一综述。关键词双链RNA;RNAi中图分类号78文献标识码∶文章编号:671-72362007)2007603Guo等(1995)于试图阻断线虫( C elegans)中这些片段可与该核酸酶的 dsRNA结合结构域结合par1基因的试验中发现了一个意想不到的现象:并且作为模板来辨识 target mRNA;识别之后,此他们本来利用anti- sense rna技术,可达到特异性mRNA与 dsRNA sense chain发生链互换原先dsR阻断par-基因的表达同时亦在其对照组试验中,NA中的 sense chain被mRNA代替,而从 enzyme注射 sense rna到线虫体内预期可能观察到此基 dsRNa complex中释放出来,mRNA则位于原先因表达的增强。但得到的结果竟是二者都切断了 sense chain的位置。同时此核酸酶亦在同样位置对par-l基因的表达途径。这与传统上对anti- sense mRNA进行切割,这样又产生了21~23bp长的RNA技术的解释竟是正好相反。研究小组一直没 dsRNA小片段再度与核酸酶形成复合物继续对能把这个意外结果予以合理的解释。直到1998年 target mRNA进行切割从而使目的基因沉默,无法2月华盛顿卡耐基研究院的 Andrew和马萨诸塞大作用进而产生RNAi现象学医学院的 craig才首次揭开这个悬疑之谜。通过2RNAi的应用大量艰苦的工作他们证实、Guo等遇到的 sense2.1高通量研究基因功能基因功能研究现在已RNA抑制基因表达的现象,以及过去的anti- sense经明确双链RNA干扰(RNAi)技术不仅可抑制体RNA技术对基因表达的阻断都是由于体外转录所外细胞中特定基因的表达而且也可抑制体内特定得的RNA中污染了微量双链RNA( dsRNA)而引起基因的表达。在功能基因组研究中需要对特定基的。当他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注因进行功能丧失或降低突变以确定其功能。可以射线虫时发现基因抑制效应变得十分微弱而经过预见RNAi作为一种快速静默基因的途径将会越纯化的双链RNA却正好相反其能够高效特异性阻来越多地用于哺乳动物基因研究。将功能未知的基断相应基因的表达。该小组将这一现象称为RNA因的编码区(外显子)或启动子区,以反向重复的方T#i RNA interference RNAi)式由同一启动子控制表达。这样在转基因个体内转随后在短短一年中RNA现象被广泛发现于录出的RNA可形成 dsrnA产生RNA干扰使目的真菌、阿拉伯芥水螅( Lohman等1999涡虫、锥基因沉默从而进一步研究目的基因的功能。根据虫斑马鱼mha等2001)等多数真核生物中。这所选用序列的不同可将其分为编码区RNA和启种存在机制揭示了RNA很可能出现在生命进化的动子区RNA早期阶段。随着研究的不断深入RNAi的机制正逐由于RNAi能高效特异的阻断基因的表达因步被阐明同时亦成为功能基因组研究领域中的有而RNA成为研究基因功能的很好工具。 Gonczy等力工具RNAi也越来越为人们所重视(2000和 fraser氰2000)利用RNAi手段分别进行1RNAi的作用机制了这方而的学讨C灬w等坚线虫3号染色体2232当dRNA导入细胞后,可被一种dRNA特个基中国煤化工并注射到线虫性腺异的核酸内切酶识别切割成21~23bp的小片段内CNMHG出现的异常表型结果发现了133个基因与细胞分裂异常有关其中104收稿日期200607-26个基因以前没有发现有这种功能找到了6个与已作者简介汪军1982-)男江苏人硕士生主要从事动物微通你石与免疫学方向的研究。知的与早期胚胎细胞分裂相关的基因(共7个)这个试验结果证明了RNA方法的有效性与可靠性中国畜牧兽医2007年第34卷第2期遗传繁育Fraser等将线虫1号染色体上的2416个基因对应及正常细胞。随着这一研究结果近日的公布另一个的 dsRNA构建到细菌文库中,然后将细菌喂给线小组的研究人员正设计这一技术在世界上的第1次虫观察形态学的异常、性别比例的变化、不孕的情临床试验将在一组艾滋病患者中进行。由于双链况结果将与这些表型有关的基因从70个增加到RNA干扰通过使有害的基因静默”而奏效因而科378个。这2个研究小组的研究极大地扩展了对线学家认为可用其来静默感染的病毒基因或已转为恶虫基因组中已知序列但功能未知的基因的认识同性的肿瘤细胞从而使他们变得无害。时研究提示在进化中保守的基因更倾向于具有2.4基因改造据报道英国剑桥大学分子病毒学RN蛀ⅰ相关的表型而43%具有RNAi表型的线虫基家泰利与苏格兰罗斯林研究所的桑博士进行有关研因在果蝇中找到了同源序列这无疑也将为不同物究证明鸡只细胞可通过注入少量基因物质产生抵种中同源基因的研究工作提供重要的参考资料抗禽流感的能力。研究小组目前使用3个方法同步研究人员对该技术在植物中旳应用亦开始探索进行研究其中一种是制造细小的核糖核酸分子利其可能性。加州理工大学的 Chuang等使用此技术用RNAi技术,影响病毒的正常运作。除了H5N研究拟南芥"的AG、CLV3、 API PAN4个与开花型禽流感这种方法还可以防范其它传给人类的禽相关的基因。结果表明:使用RNAi技术可以产生流感病毒例如2003年导致荷兰一个农场爆发疫情功能丧失或降低的突变体而其表型与以前使用其的H7型病毒,它方法鉴定的突变体类似。使用RNA原位杂交方2.5基因敲除早期,虽然传统的基因敲除技术被式可表明在RNAi突变体的 target mRNA显著降广泛用于一些功能基因的研究但在实际应用中存在低。该结果说明RNAi技术亦可成为植物功能基因一些不容忽视的问题①它不利于在短期内研究数量组研究中的有力工具。较多的基因若希望一次性敲除2个或多个基因对2.2研究信号转导通路由于RNAⅰ能高效特异于传统的基因敲除非常困难若希望研究某一突变的阻断基因表达,它成为研究信号传导通路的良好致死基因在特定胚胎发育阶段的功能传统的基因敲工具。在线虫体内胰岛素和受体结合后可以活化除无法满足研究的需要因为胚胎可能在早期就因为Dsorl他是Mek的类似物, Dsorl活化后可以激活缺失此基因而死亡③3在某些制造基因敲除动物模型EekA他是ERK的类似物。用以 Sort为靶目标的分困难或因伦理学原因根本不可能进行的物种中dsRNA可以阻断Dorl的表达虽然总的FkA表达(如大型动物及人)传统的基因敲除也无法应用(陈不受影响但由于υsorl表达被抑制从而胰岛素受吉刚等2004 )o RNAi可以有效地弥补传统基因敲除刺激后ErkA不能活化。的上述缺点它可以在短时间内对多个基因进行研2.3基因治疗用RNAi特异性地抑制如艾滋病究。对于哺乳动物RNAi能在体外培养的细胞中达病毒基因、肝炎病毒基因、癌基因、癌相关基因或突到基因敲除的效果对于一些敲除后的小鼠在胚胎时变基因的过度表达使这类基因保持在静默或休眠就会死亡的基因,可以在体外培养的细胞中利用状态从而有望用这种新的手段治疗各种病毒性疾RNA技术研究它的功能。 Elbashir等2001)使用21病和恶性肿瘤等疑难病症。而肿瘤是多基因、多因 bp dsrna避免了干扰引起的细胞非特异性应激反素疾病单个癌基因的抑制往往很难达到治疗效果。应实现了在一系列哺乳类细胞系中包括人类宫颈但RNAi技术能够同时抑制多个不同基因而且抑癌细胞及胚胎性肾细胞系293中 dsRNA对特定基因制效果互不干扰。此外RNAi识别可以精确到一个表达的抑制作用。目前腺病毒是体內转基因的常用核苷酸对由野生型点突变形成的癌基因,如ras、载体Ⅻia等(2002)用腺病毒作载体在体内和体外p53等能够产生准确有效的封闭效果野生型基因表达 dsrNa并成功阳断了基因的表达从而实现了则不受影响。试验结果证明bcl-2、CDK-2、PIK-1和成体动物的基因敲除p53等肿瘤相关基因的RNAi能够使人类宫颈癌细2.6基因表达调控 Bender等(2002)发现RNAi胞Hela)增生速度减慢恶性程度降低凋亡加快。在实肝瘋Hep3B)非小细胞肺癌H2头颈部鳞状胚胎中国煤作扮演重要角色。实验达的改变而基因的细胞癒(C33A)骨肉瘤(U20s)及前列腺癒(LN编码CNMH控的一种类型是染色CaP)白血病等细胞系中的试验也发现类似效应。体的改变通过改变染色体的形状(更紧或是更此外将RNAi应用于 Wilson病等先天遗传性疾病的松)决定那一个基因表达。但什么促进了染色体体外试验也获得令人满意的成果。科学家采用这项形状的改变以前并不清楚。 siRNA( small interfering技术完全清徐棼羅长在试管中的所有癌细胞而未伤RNA)在染色体形状的改变中起着非常重要的作遗传繁育中国畜牧兽医2007年第34卷第2期用。这样RNAi能永久的关闭基因表达而不仅仅是短期的抑制它。通过在发育过程中关闭或开放基参考文献因的表达, siRNA可能指导着细胞的定向分化。I Bender J. Plant epigenetics[ J ]. Curr Biol -2002, 12( 12): 412RNAi已被证实能引导植物干细胞分化因而研究者认为RNAi也可能参与指导人的干细胞分化。由于2 Elbashir S M, Harboth J Lendeckel W,tl., Duplexes o21 nucleo-RNAi在基因表达调控中发挥重要的作用对RNAitide rNAs mediate rNa interference in cultured mammalian cells微小的干扰就可能导致肿瘤的发生。J] Nature2001411(6836)a93问题与展望Fraser A G, Kamath R S Zipperlen P, et al. Functional genomic a-nalysis of C. eleans chromosome I by systematic RNA interference虽然此技术在非脊椎动物中的应用已取得一些[J]. Nature2000408(6810)325-330重要的成果但在哺乳动物中的应用才刚刚起步。4 Gonczy P Echeverri C Oegema K,eta. Functional genomic analysis在哺乳动物细胞中RNAi并不能完全阻断基因的表of cell division in C. elegans using RNAi of genes on chromosomelll达特别是表达异常高的基因淇次RNAi并不适应J] Nature2000A08(6810)331-336所有的基因如 dsRNA对一些在神经细胞中发挥功Guo SKemphues K J. Par-1 a gene required for establishing polaritin C. elegans embryos, encodes a putative Ser/Thr kinase that is能的基因抑制作用不明显湯外运载体系一直是体asymmetrical distributed[ J ]. Cell 1995 81(4)611-620内基因治疗的瓶颈如何将双链RNA高效特异的转6 ohmann J U Endl I Bosch TO. Silencing of developmental genes入体内仍是一个难题。但RNA技术的运用对生命drtJ] Dey biol999214(1)211-~214.科学的深远影响将不会低于PCR技术(胡迎春7 Xia H B ,Mao Q W Paulson H L et al. Si- RNA mediated gene silen-2004)RNAi技术体系的建立为人类基因功能研ing in vitro and in vivo[ J ]. Nat Biotechnol 2002, 20: 1006-1010究和疾病基因治疗开辟了一个革命性的新领域。我8 Zhao Z Cao Y,LM,tal. A Double- stranded RAN injection pr们相信,该技术以其较其他多种技术的突出优点和duces nonspecific defects in zebrafish[ J]. Dev Biol 2001 229(1)在各领域中的突出优势在未来将会有更多更广阔的发展前景。The Application of RNA InterferenceWANG Jun, ZHANG Yi-fang, ZHANG YeCollege of Animal Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201 ChinaAbstract: Putting double-stranded RNA into cell could cause homologous genes silencing. This phenealled rNa interference. In this paper, the history mechanism of action application and perspective of RNA interference were summarized. Espe-cially summarized from the application of RNA interferenceKey words: double-stranded RNA RNA interference不同年龄和性别的快速生长鸡氮维持需要和氮沉积潜能的研究Samadi等著刘蓓一周秋燕摘译施寿荣校摘要本试验是为了估测不同年龄和性别的快速生长鸡毎日的氮维持需要NMR)和毎日氮沉积澘能( NDmaxt)在氮平衡试验中用144只公鸡和144母鸡在4个连续的生长期做了相应的研究(Ⅰl0~25d;Ⅱ30~45d;Ⅲ50~65d;I085d)。试验日粮由高蛋白质大豆和氨基酸晶体作为蛋白质来源又各设了6个梯度的蛋白质水平(N1=6.6%N2=13.0%N3=19.6%N4=25.1%N3=31.8%N=37.6%)。通过食入氮和总氮排出量的指数函数来确定氮维持需要。氮维持需要的平均值22 emg N/BW,d)用于进一步计算NDmT即为食入到中国煤化工本试验采用SPS.5Levenberg- Marquardt algorithm模型估测阈值相对应的得出公鸡4个:CNMHG分别为359.27231702、1386mgN/BWa,d母鸡的分别为3452、2604、1501、1286mgN/BN仔出的楔型李数是估测氨基酸需要的前提而估测氨基酸需要主要以氮利用指数模型为基础再由生产性能和日粮氨基酸利用率而定。这个程序将会在随后的文章中得到进一步的完善和应用。关键词氮维持需要生长潜能氮沉积生长鸡漒白质代谢模型原载予有款据1:mc20105421-12