喹乙醇人工抗原的合成与鉴定

北容业学报2010,19(7):1-6Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica喹乙醇人工抗原的合成与鉴定宋春美12,高爱中3,邓瑞广1,职爱民1,郅玉宝1,侯玉泽2,张改平1(1.河南省农业科学院,农业部动物免疫学重点开放实验室河南省动物免疫学重点实验室,郑州4500022.河南科技大学食品与生物工程学院,河南洛阳471003;3.杭州隆基生物技术有限公司,杭州310011)摘要:采用琥珀酸酐法合成喹乙醇半琥珀酸酯(OLA-HS),以质谱法对其进行鉴定;活化酯法合成全抗原O.A-BSA、 OLA-OvA,以紫外(UV)和凝胶电泳( SDS PAGE)鉴定之;用 OLA-BSA免疫BALB/c小鼠,间接ELISA测定多抗血清效价,阻断 ELISA鉴定其敏感性、特异性。紫外扫描测得 OLA-BSA、 OLA-oVA中OLA-HS和BSA,OVA的分子结合比分别为17.1:1和12.4:1;3号小鼠抗血清的效价最高,对OLA的IC为58.923ng/mL,与卡巴氧的交叉反应率为1.841%与其他药物无交义反应。通过系列ESA鉴定,获得高价、敏感特异的多克隆抗体(pAb),为OLA残留免疫学检测方法的建立奠定基础关键词:喹乙醇;人工抗原;合成;鉴定中图分类号:S859.84文献标识码:A文章编号:1004-1389(2010)07-0001-06Synthesis and Characterization of Artifical Antigen of olaquindoxSONG Chunmei,, GAO Aizhong DENG Ruiguang, ZHI Aimin'ZHI Yubao', HOU Yuze 2 and ZHANG Gaiping(l. Key Laboratory of Animal Immunology of the Ministry of Agriculture, He'nan Provincial Key Laboratory forAnimal Immunology, He'nan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450002. China; 2. Food andBioengineering College, He'nan University of Science and Technology, Luoyang He'nan 471003, China3. Hangzhou Clongene Biotech Co, Ltd, Hangzhou 310011.ChinaAbstract: The derivative of olaquindox, called as OLA-SH, was synthesized by succinic anhydridemethod and identified by mass spectrometry(MS). Two complete antigens of olaquindox(OLA-BSAOLA-OVA)were prepared by active ester method(AE). The characterization of hapten-protein conjugates were examined by two methods, ultraviolet spectrophotometry (UV), and sodium dodecyl sul-fate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE), respectively. BALB/C mice were immunizedwith OLA-BSA, the titre of polyclonal antibody( pAb)was detected by indirect ELISA, the sensitivityand specificity of pAb was identified by blocking ELISA. According to UV scanning, the conjugationratio of OLa- HS to BSa and ova was about 17. 1: I and 12. 4:1. The titer of pAb for No. 3 mousewas the highest, its ICso was 58. 923 ng/ mL, cross reaction rate to carbadox was 1. 841%, and nocross reaction to other antibiotics. The high-titer, sensitive and specific anti-Ola p Ab have been pro-duced in sera of ELISA, which made it possible to establish immunoassay of oLa residues.Key words: Olaquindox; Artificial antigen; Synthesis; Identification喹乙醇( Olaquindox,OLA)属于喹啉类化合物,最早由西德 Byer公司研制开发,是目前在收稿日期:200909-10修回日期:2010-03-15H中国煤化工基金项目国家十一五”科技攴撑计划项日(2006BAK02A21)第一作者:宋春美女,顿士研究生,研究方向为食品安全检测。 E-mail zhCNMHG通讯作者:张改平,男,中国工程院院士,博士生导师,主要从事动物免疫学和鲁药残留研究。Emil: hanggaiping2003@ yahoo.西北农业学报19卷中国生产和广泛使用的具有抗菌、促生长作用的郑州大学医学院实验动物中心,河南省农业科学化学合成饲料添加剂口。OLA是一种基因毒剂院农业部动物免疫学重点开放实验室饲养和生殖诱变剂,有致突变、致畸作用2。研究发1.3主要仪器现,长期使用后,OLA在畜禽体内和生态环境中Quattro micro API三重四级杆质谱仪,美国造成蓄积残留,可通过食物链间接地对人类健康 Waters公司;DU-600核酸蛋白分析仪,德国造成威胁。鉴于此,国家对其使用做出了严格 BECKMAN公司; Bio- rad-550型酶标仪,美国限制。《中国兽药典》和农业部第168号公告《饲 Bio-rad公司;AE260电子天平,德国MET料药物添加剂使用规范》中规定:OLA禁用于禽、TLER公司;3K-18高速冷冻离心机,德国 Sigma鱼和体质量超过35kg的猪,动物屠宰前或上市公司;凝胶成像系统及分析软件, Syngene公司;前的休药期为35d20。并规定其在猪肝脏和肌超净工作台,美国 Forma Scientific公司;JM250肉中的最大残留限量分别为50和4gg/kg3).电泳仪,大连捷迈科贸有限公司;DK8D电热恒目前检测OLA残留的方法主要有薄层色谐温水槽,上海一恒科技有限公司;Sz93自动双重法、高效液相色谱法、质谱法、液质联用纯水蒸馏器,93-3定时恒温双向磁力搅拌器,上法01等,这些方法不但需要复杂昂贵的仪器,而海亚荣生化仪器厂;旋转蒸发仪,巩义市予华仪器且需经过繁琐的前处理,很难达到快速、简便的现有限责任公司场检测要求。而在动物的复杂基质中开展痕量残1.4方法留分析特异性、灵敏度、准确性、分析成本与效率1.4.1琥珀酸酐法合成喹乙醇半琥珀酸酯是最为重要的考核指标;免疫化学技术特别是酶( OLA-HS)参照文献[13]所述方法,并对其进免疫分析技术,具有高选择性、高灵敏度和高通量行改进。称取26.30gOLA和13.00g琥珀酸酐特点恰好可以满足上述要求,必将在OLA快速( Succine anhydride,SUA)置于500mL反应瓶检测方面发挥重要作用12。本研究旨在合成并中,加入100mL二甲基亚砜(DMSO)作为溶剂,鉴定OLA的人工抗原,为其残留免疫学检测方90C反应1h;将反应液冷却至室温,缓慢加入法的建立和拥有自主知识产权检测产品的开发奠400mL蒸馏水中,边滴加边搅拌,溶液中析出大定基础。量淡黄色沉淀;抽滤沉淀,用冰蒸馏水洗涤后抽1材料与方法干,50℃烘干,用蒸馏水进行重结晶,重复3次干燥得淡黄色针状结晶,即为 OLA-HS,合成路1.1试剂与溶液线见图1。OLA标准品(纯度99%),Dr. Ehrenstorfer;1.4.2活化酯法合成OLA人工抗原称取牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA), Pierce10.96 mg OLA-HS溶于500μLNN二甲基甲产品;弗氏完全佐剂(FCA)和弗氏不完全佐剂酰胺(DMF)中,加入9.34mgN,N二环已基碳(FIA), Gibco产品;四甲基联苯胺(TMB), Sigma二亚胺(DC),用200LDMF溶解4.17mgN产品;羊抗鼠酶标二抗( GaMIgG-HRP),华美生羟基琥珀酰亚胺(NHS),将其滴加到上述溶液物工程有限公司产品;试验用水为超纯水河南省中,室温搅拌反应8h,此为反应液A;另称取农业科学院农业部动物免疫学重点开放实验室制20.00 mg bSa溶于2.00mL0.01mol/L,pH备;其他试剂市售所得,均为AR级。7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中,此为反应液B。将洗液(PBST)为0.01mol/L、pH7.4的磷酸反应液B置于磁力搅拌器上,4℃下将反应液A盐缓冲液(PBS),含0.5mL/ L Tween20;包被液缓慢滴加到反应液B中,搅拌反应过夜。次日将为0.05mol/LpH9.6的碳酸盐缓冲液(CBS);反应液置于处理过的透析袋内,在PBS中透析3间接 ELISA的封闭液、稀释液为含50mL/L猪d,离心弃沉淀,分装并贮于-20℃备用。交联产血清的PBST;酶底物为TMB的磷酸柠檬酸缓物命由回图2。同理合成冲液;终止液为2mol/L的硫酸溶液。包被中国煤化工1.2实验动物YHaNMHGSPF级6~8周龄雌性BALB/c小鼠,购自宋春美等:喹乙醇人工抗原的合成与鉴定CONHCH, CH, OHCONHCH, CH, OCCH CH, COOHDMSOLAUAOLA-HS图1半抗原 OLA-HS合成路线Fig 1 Synthetic routes to the haptenONHCH2CH2OCCH, CH2 COOHDCCOLA-HSNHSBSACONHCH2CH2OCCHCH2C0--0--N中间体 Intermediate productCONHCH, CH,OCCH, CH, CONHOLA-BSA图2活化酯法合成OLA-BSA路线Flg. 2 Synthesis scheme of OLA-BSA by active ester method1.4.3UV鉴定OLA人工抗原用PBS配制用文献[15]介绍的方法,浓缩胶体积分数为50OLA-HS、BSA和OVA的标准溶液,将免疫原和mL/L,分离胶体积分数为100mL/L,浓缩胶电包被原按一定比例稀释,用 Braford法测定其蛋压70V,分离胶电压85V,上样量为20μL,考马白质质量浓度,据此质量浓度调节免疫原和包被斯亮蓝染色5~6h后,置脱色液中脱色过夜。原溶液中的蛋白质质量浓度分别与BSA和OⅴA1.4.5 OLA PAb的制备用 OLA-BSA免疫的标准溶液致在波长20-50m范围内进周龄!V凵中国煤化工每只0.2mL行紫外扫描,参照文献[14]所述方法分别计算(含量CNMHG射。首免,用OLA-HS与BSA和OVA的分子结合比。无菌PBS溶解 OLA-BSA,与等量FCA混合,充1.4.4 SDS-PAGE法鉴定OLA人工抗原采分乳化;加强免疫,用无菌PBS溶解 OLA-BSA,西北农业学报19卷与等量FIA混合,充分乳化首免后4周进行共BSA与 OLA-HS偶联后,两者的峰叠加并位移免4次每次间隔2周,最后1次免疫后10d断至261nm,与BSA、 OLA-AS的紫外吸收曲线相尾采血分离血清。比, OLA-BSA的紫外吸收曲线都发生了改变既1.4.6 OLA PAb的鉴定效价测定:采用间接具备BSA的紫外吸收特征,也具备 OLA-HS的ELISA测定pAb效价,基本程序参照 Tijssen的紫外吸收特征,表明 OLA-HS与BsA偶联成方法。第1步,用 OLA-OVA包被,包被质量功1。同理证明 OLA-OVA偶联成功。依据朗浓度0.5gg/mL,包被量每孔100μL,37℃温育2伯比尔定律推算出 OLA-BSA的分子结合比约为h,PBST洗板6次(下同);第2步,用50mL/L17.1:1, OLA-OVA的分子结合比为12.4:1猪血清封闭,每孔200μL,37℃温育1h,洗板;第3步,加多抗血清,每孔50μL,用封闭液倍比稀释,设阴性对照(NC)和空白对照(BC),37℃温育15min,洗板;第4步,加 GaMigG-HRP,用封倒台60闭液1:1000稀释,每孔50μL,37℃温育30min,洗板;第5步,加酶底物TMB显色,每孔50μL,室温反应5min;第6步,终止显色反应,每孔00220240260280300320340360380400加入终止液50μL-,用酶标仪读OD4s;第7步,结果判断,以待测孔OD45≥NCOD450的2.1倍(P/N≥2.1),判为阳性图3OLA的质谱图敏感性测定:采用阻断 ELISA鉴定其敏感Fig 3 ESI-MS spectrum of OLA性。阻断 ELISA测定抗血清对OLA的半数抑制质量浓度(IC5),并以ICs作为敏感度,操作步80骤与间接 ELISA的区别在于第3步加OD5为E百701.0的小鼠血清50μL和不同质量浓度的OLA腮g50溶液(抑制剂)50μL。特异性测定:采用交叉反应试验鉴定其特异性。交叉反应试验选择OLA及卡巴氧、乙酰甲喹、磺胺间甲氧嘧啶、嗯喹酸等竞争物,用阻断200220202803003203403603ELISA测定各竞争物的IC0,以pAb对OLA的质荷比m/zICs与各竞争物的IC50之比的百分数为其交叉反图4OLA-HS的质谱图应率(CR%)。Fig 4 ESI-MS spectrum of OLA-HS2结果与分析2.1 OLA-HS的质谱鉴定结果图3为OLA标准品经 ESI-MS检测后的图谱,最强m/z286.7为[OLA+Na]的分子离子峰;图4为OLA衍生物( OLA-HS)的 ESI-MS图谱最强m/z386.8为[ OLA-HS+Na]的分子离子峰,表明新合成化合物的分子量为362.8,与其理论分子量363.1基本一致,初步证明OLA220240260280300320340360380400420440460480500的衍生化是成功的。中国煤化工2.2OLA人工抗原的UⅤ鉴定结果人工抗原、载体蛋白和半抗原的紫外扫描结CNMHG浆外扫描光谱·rof BSA果见图5、图6。由图5可知,BSA的最大吸收峰OLA-HS and OLA-BSA在278nm, OLA-HS的最大吸收峰在259nm,7期宋春美等:喹乙醇人工抗原的合成与鉴定2.4 OLA PAb的鉴定结果2.4.1 OLA PAb效价和敏感性测定结果间接 ELISA效价见图8,Co结果见图9。由图8可知,免疫的3只小鼠血清抗体效价均达到了10ˉ‘,获得了较好的免疫效,3号鼠血清效价最小鼠1 Mouse1小鼠2 Mouse小鼠3 Mouse322024026028030032034036038040042040460480500图6 OVA. OLA-HS和OLAOⅤA的紫外扫描光谱Fig. 6 UV scanning spectrum of ovAOLA-HS and OLA-ovA2.3OLA人工抗原的 SDS-PAGE鉴定结果200如图7所示,免疫原和包被原 SDS-PAGE电OLA PAbl的稀释度泳条带的迁移率均比各自载体的迁移率小,且有Diluted concentration of OLA pAb(10")明显的拖尾现象,说明偶联物的分子量大于载体图8小鼠血清效价的分子量,偶联成功1。Fig 8 Titer curve of BALB/e mice antiseraMarker BSA OLA-BSA OVA OLA-OvA小鼠1 Mouse l小鼠3 Mouse37.4ku66.2ku43.0kuy=-0.2166x+0.563531.0kuc5o=58.923ag/mL20.0ku14.4ku0.51.0图7人工抗原及其载体的 SDS-PAGE结果Ig[OLA dilution/30(og/mL)图9pAb对OLA的阻断 ELISA抑制曲线Fig 7 SDS-PAGE electrophoresis of artificialFig 9 The inhibitive curve for pAb toantigen and its carrierOLA by blocking ELISA表1 OLA pAb与其他竞争物的交叉反应Table 1 The crossreactivity of oLA pAb with compete compounds半数抑制质量浓度/(ng/mL)交叉反应性/%乙醇 Olaquindox58.923卡巴氧 Carbadox乙酰甲喹 Maquindox>5.0×100.I18磺胺间甲氧嘧啶 Sulfamonomethoxine>5.0×10<0.118磺胺嘧啶 Sulfadiazine>5.0X104<0.118呕哮酸 Oxolinic Acid>5.0X10<0.118青霉素 Penicillin5.0×104四环素 Tetracycline中国煤化工0.18氯莓素 Chloramphenicol新莓素 NeomycinTHCNMHG菜克多巴胺 Ractopamine>5.0X104<0.1186西北农业学报19卷高;由图9可知,3号鼠的IC5最低,达到58.923[3]孙雷韩嘉媛汪霞等.嗤乙醇的毒理学研究概况[Jng/mL,线性回归方程为y=-0.2166x+中国鲁药杂志,2008,42(1):41440.5635,相关系数R2=0.987,符合线性关系的判[4]刘维华,刘学琴,吴彦虎,等.HPLC法测定饲料中唯乙醇的研究[J.中国鲁药杂志,2007,41(10):29-30定标准,故选择3号鼠为细胞融合备用鼠。[5]农业部畜牧兽医局农业部发布动物性食品中兽药最高残2.4.2 OLA pAb特异性鉴定结果由表1可留限量(续)[.中国兽药杂志,2003,37(4):1520.知,OLA抗血清对卡巴氧有1.841%的交叉反应[6]刘安南薄层色诺法鉴别中西复方制剂中唾乙醇成分[J性,对其他药物无交叉反应江西饲料,2001(1):23[7] dos Ramos F], da Silveira IN, de Graaf G. Column liquid3讨论in feeds[J] Journal of Chromatography A,1991,5583.1关于OLA人工抗原的合成125-130.OLA是小分子化合物必需与大分子的载体[8]杨文军张丽英李德发,等反相高效液相色谱法测定饲料蛋白偶联后才具有免疫原性。但OLA本身并没中唾乙醇的含量[门.中国兽药杂志,2003,37(2):20-23有合适的活性功能基团可直接连接到载体蛋白9 Miao x s. Raymond E M, Chris D M. A tandem mass上,必须先将其羟基转换成羧基才能与载体蛋白spectrometric study of the N-oxides, quinoline N-oxidescarbadox, and olaquindox, carried out at high mass accura-偶联。对比文献[13]描述的方法,优化试验条件,cy using electrospray ionization[J]. International Journal of将反应溶剂吡啶更换为DMSO,降低控制温度,Mass Spectrometry, 2003. 230: 123-13由原来的125℃降至90℃,这样使得反应装置简10] vanpoucke, keyser, Baltusnikiene A,ea. Liquid单化,只在旋转蒸发仪上便可完成;反应时间由hromatographic-tandem mass spectrometric detection ofh缩短至1h;避免了吡啶的难闻气味和对身体的banned antibacterial growth promoters in animal feed[j].Analytica Chimica Acta. 2003, 483: 99-109损害同时产率从702g/kg提高到823g/kg。对[]杨文军,张丽英,贺平丽等.高效液相色谱质谱联用法测于含羧基的半抗原,其人工抗原的合成常采用混定饲料中喳乙醇[J.中国饲料,2006(20):33-36.合酸酐法活泼酯法或碳二亚胺法。采用活泼12]吴永宁,邵兵沈建忠,等兽药残留检测与监控技术[M酯法,并和混合酸酐法进行对比,结果表明,活泼北京:化学工业出版社,2007,621-645酯法比混合酸酐法的免疫效果更佳,故将选用活[13]朱学加陈金兰,何计国.疃乙醇人工抗原的合成及鉴定[J].食品科学2008,29(5):129-133.泼酯法免疫的小鼠进行下一步试验。[14]杨利国胡少昶,魏平华,等酶免疫测定技术[M].南京:3.2关于OLA人工抗原的鉴定南京大学出版社,1998:252-258.鉴定小分子人工抗原常用的方法有UV、红[5]郭尧君.蛋白质电泳实验技术[M北京:科学出版社,外色谱(IR)、 SDS-PAGE、核磁共振碳谱(C13NMR、标记抗原示踪法等。但人工抗原能否刺160 Tijssen P. Practice and theory of enzyme immunoassay激动物产生针对半抗原的特异性抗体,是判断人[17肖理文,袁耀萍,鄙日沫,等四环素人工抗原的合成与鉴工抗原合成成败的核心21.小鼠免疫试验结果定[]].细胞与分子免疫学杂志,208,24(4):419421显示,所合成的OLA人工抗原能有效刺激小鼠[8]肖甄磊谢忠良何计国.卡巴氧的代谢物喔啉2駿酸人机体发生免疫应答,产生针对OLA的特异性抗工忼原的合成及其多克隆抗体的制备[冂].食品科学体,为抗OLA单克隆抗体的研制及免疫学分析2008,29(5方法的建立奠定了基础。[19]张改平,刘宜兵,彩鸿翔,等新霉素人工抗原的合成与鉴[20]洪孝庄,蛋白质连接技术[M]北京:中国医药科技出版参考文献:社,1993:34.[1]林顺全饲料中乙醇含量检测方法的比较研究D]雅安:[21]沈关心,周汝瞬现代免疫学实验技术[M].武汉:湖北科四川农业大学,2004:11技出版社,19[2]邓云波,段苏华,陈启友,嗉乙醇的特性及其合理使用[J湖南裔牧鲁医,2004(1):14-1中国煤化工CNMHG