人Ⅰ型精氨酸酶的聚乙二醇修饰条件探索

科技资讯200 NO.30SCIENCE & TECHNOU oev INFORMATION动力与电气工程人|型精氨酸酶的聚乙二醇修饰条件探索郝德旺’梅丹2 刘庆洪(1.中国农业大学农学与生物技术学院北京 100193 2. 丽水职业技术学院环境工程分院园艺生物系浙江金华321 000 :3.中国农业大学生物学院微生物系北京100193)摘要;精氨酸酶,叉名L-精氮酸尿素水解酶,是一种将精氮酸水解成鸟氦酸和尿素的水解酶,本身为内源性蛋白酶在人体内尿素楠环中起到重要作用。工业上可利用其水解活性以精氨酸生产乌氨酸。另外,精氨酸酶还有着显著的抑制肿瘤细胞分裂的作用0一到。但是,在临床应用中，存在以下缺点:体内循环半表期短,易被循环系统清除,需要多次给药等问题，给患者的日常生活带来很大的不便。而聚乙二醇(Polyethylene Glyeol ，PEG)化学修饰能够降低蛋白免疫原性以及有效延长药物半表期,是解决上述问题的有效途径之一团。关键词:人I型精氨酸酶聚乙二醇中图分类号:06文献标识码:A文章编号:1672-3791(2009)10(e)-0090-02自上个世纪80年代以来,FDA批准了第来寻找最佳的修饰办法,为进一步考察其种因素 ,固定反应温度为4C ,探讨了pH值一个PEG化药物聚乙二醇修饰的酰苷脱氨酶特性奠定基础。对单修饰产物体外活性保留的影响,以及(PEG-. ADA), PEG修饰技术在长效药物的制离子类型.离子强度.蛋白质浓度.修饰剂/备研究中已经取得了很大的进展,成为近年1 材料和方法蛋白质配比、反应时间等条件对修饰转化来医药领域研究的热点之- - 。目前,已经上市(1)材料。原料:单甲氧基聚乙二醇丙醛事的影 响。的聚乙二醇药物包括PEG化天冬酰胺酶(北京凯正生物),重组人精氨酸酶(Escheri-(1)在修饰剂类型、分子量固定的情况(PEG -L- asparaginase)4,以及重组人粒细胞集chia coli 表达)。 主要试剂:牛血清白蛋白、下， 修饰反应条件对单修饰产物体外活性落刺激因子(egfilgrastim)等蛋白质药物”。(SIGMA),丙烯酰胺(SIGMA),甲叉丙烯酰胺保 留的影响主要取决于修饰位点。只有修对于精氨酸酶的聚乙二醇修饰研究，(SIGMA),其余试剂均为国产分析纯试剂。饰位点远离蛋白质活性部位的时候,修饰已经取得了很大成果和进展。目前已有产(2)方法。修饰反应:在低温4C ,将重组人精蛋白才 能得到较高的活性保留。不同氨基品完成了临床前实验,为5kD线形单甲氧基氨酸酶透析到所需缓冲溶液中。使用BCA法酸残基 ,其pKa值不同，因而在不同的pH值聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯(NHS-mPEG)进行蛋白浓度测定,调整蛋白浓度至实验所条件下,其亲核性有较大差别。因而溶液的修饰6,其体外活性保留为未修饰蛋白的需值,按照摩尔配比(修饰剂/蛋自质)加入pH值影响了蛋白质的修饰位点,是影响修50%，活性下降很多。修饰剂及还原剂,混合均匀,4C反应,结束饰产物活性的最主要要因素.图1显示了pH为了解决以上问题，本研究采用10kD后,使用甘氨酸终止。蛋白质浓度的测定:使对单修饰产物活性保留的影响。可以看出，单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG- ALD)修饰用BCA法进行蛋白质浓度测定"。单修饰产物体外活性随着pH值的增大先增剂对精氨酸酶进行了修饰,通过控制反应大后减小，在pHS. 5时单修饰产物活性最高。条件,希望能够获得半衰期更长的PEG化2结果与讨论推测可能由于在pH=5.5的条件下,mPEG-精氨酸酶产物。通过考察不同的修饰条件为考察对单修饰产物转化率影响的各ALD主要修饰在蛋白N端氨基酸上,从而保120%60%100%50%望80%丹40%车30%40%哥20%20%10%0% l0%4.555.566.51152pH蛋白浓度(mg/mI)图1pH对单修饰产物活性的影响图2蛋白浓度对单修饰辜 的影响30%0%‘020中国煤化工3反应时间( h)YHCNMHG蛋白配比图3反应时间对单修饰率的影响图4修饰配比对单修饰辜的影响(下转92页)9科技资讯SCIENCE & TECHNOLOGY INFORMATION科技资讯2009 NO.30SCIENCE & TECHNOLOGY INFOPRMATION动力与电气工程口落差达到8m,水流条件好。隧洞进口高程大坝右岸,全长252.56m,隧洞进口直线段中期导流:第二年汛期(5月~ 10月),根为1153. 00m,出口高程为1145.00m,底坡为长42. .90m,洞线方向为N2.59" E,转弯段长据施工,总进度安排,大坝浇筑到1167.50m3%。.上述两个方案技术经济比较如下。78.39m,转弯半径为100m,转角44.92* ,出高程 ,并在1157.00m高程大坝溢流堰右侧4.1.1经济指标.口直线段长131.27m,洞线方向为N47.68预留宽50m的缺口,导流洞、冲砂底孔和大方案-造价约为884万元，方案二造价E。隧洞进口底板高程为1153.00m,出口底坝缺口 联合泄流,拦河坝进行预留缺口两约为869万元,从单一的导流工程来看两个板高程为1145.00m,底坡为3.2%。侧的混凝土浇筑。方案经济指标上两个方案差不多,但是方4.2.2隧洞断面型式选择后期导流:第二年11月~第三年4月，案二是结合永久泄洪洞来设计,对整个工考虑到导流洞设计与泄洪洞相结合，通过 导流洞过流，拦河坝进行缺口部分混程来说方案二在导流工程方面几乎是零投导流洞断面采用圆型断面设计,经过水力凝土浇筑、 坝体灌浆和金属结构部分施工，资(投资计入永久泄洪洞)。因此,经济指标计算,确定隧洞断面尺寸衬砌后内径为8m直 至拦河坝竣工。上方案二优于方案- - 。.四洞。4.1.2技术可行性4.3围堰设计5截流本工程上游河床宽度较狭窄,覆盖层由于本工程粘土料场储量丰富,对土5.1截流时段选择较厚,主要为大块石崩踏堆积体。其中,左石围堰施工用料有保证,故本工程園堰设导流时段为11月~次年4月,根据施工岸有不稳定崩踏堆积体,堆积体顺河向长计为土石围堰。进度安排,结合黄泥河水文条件,确定在10约100m,距坝址约80m,垂直河向长50m,体4.3.1.上游围堰设计月截流.因为11月份P=20%月平均流量为积约8万m'。经过与中国地质大学进行的专围堰设计为土石混合围堰,園堰顶宽108m/s, 截流难度不大。为能尽早进行围题分析,专题设计提出将该部分需进行清为6.5m,轴线长度为48m,最大堰高为16.堰填筑,以便于为大坝基坑施工创造条件，除处理。3m,堰顶高程为1160.30m.上游侧为堆石体因 此截流安排工程开工第一年11上旬进采用方案一，圈堰布置在峡谷中上部，截流戗堤,边坡为1: 1.5, 下游侧堆石体边施工技术上难度不大，可行性强。导流洞施坡为1 : 2.0,采用防渗土工布结合控制水5.2 截流施工工受到崩踏堆积体处理的施工干扰小,可泥灌浆进行防渗处理。截流方式采用单戗立堵截流，单向进独立施工,而且,导流洞的封堵简单;缺点4.3.2下游围堰设计占.截流前先进行备料,对坝前蹦踏堆积体是隧洞较长,施工时间长。根据导流洞出口水位~流量关系曲处理 和坝肩看挖碴料进行筛选大粒径料单采用方案二，围堰布置在峡谷中部,施线, 选定导流流量对应的水位为1144.50m，独储 备。截流时先采用大粒径料进行填筑，工技术上难度不大，可行性强。缺点是导流围堰轴线处河底高程为1137.9m.堰型为然后再用开挖碴料进行填筑。洞施工受到崩踏堆积体处理的施工干扰，土 石围堰,设计堰顶高程为1145.0m,堰顶截流戗堤料采用1. 5m'挖捆机装15t自优点是导流洞可与泄洪洞结合,减少工程宽为3m, 背水面坡度为1: 1.5,迎水面坡度卸汽车运输 ,推土机推平进占。投资,同时有利于大坝的安全运行。为1: 2。因此,选择方案二为本工程的推葬方4.4导流程序6结语根据本工程的特点,拦河坝施工导流对修建在高山峡谷地带径流量大的高4.2导流洞设计分为前期、中期和后期三个阶段。水头水电站,施工导流是工程能否实施的4.2.1洞线布置前期导流:第一年2月一10月,河道过关键， 同时也关系到项目技术经济指标。在由于导流洞和永久泄洪洞结合,导流流,进行导流洞施工:第- -年11月-第二年进行施工导流设计时，应紧密结合工程的洞布置在满足导流要求的前提下还应尽可4月,河床截留,通过导流洞过流,拦河坝进总体设计考虑,尽可能临时和永久工程结能满足泄洪洞要求。所以,导流隧洞布置于行河床基础开挖和坝基混凝土浇筑。合，节约工程投资,从而使工程顺利进行。(上接90页) .作为最佳反应条件(见图3)。度为10mg/mL时,修饰剂/蛋白摩尔配比为留了较高的体外生物学活性(见图1)。(4)修 饰配比。饰配比对单修饰转化率4:1的情 况下，反应10h.在最佳反应条件(2)修饰反应条件对单修饰产物转化率的影响见图4.可以看出，单修饰产物的转下，单修饰转化率可达到50%。本研究的修的影响。1)离子类型和离子强度:实验在相化率随 着修饰剂/蛋白配比的增加而增大。饰反 应,为进一步的实验奠定了基础。同pH值下(pH5.5),考查了不同离子类型对修 饰剂/蛋白配比进行进一- 步的探讨:随对单修饰转化率的影响。选取了磷酸缓冲着 修饰剂/蛋白配比的逐渐增加，多修饰蛋参考文献液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸一白 的转化率逐渐增加,单修饰产物转化率[1]李大力,郑迎迎.人工型精氨酸酶基因柠檬酸钠缓冲液3种缓冲体系,发现离子类先增大后减小, 在4:1的条件下存在最大的克隆及其酵母表达[J].化学与生物工型对单修饰转化率的影响并不明显,在磷值。 可能原因是由于蛋白质浓度以及修饰程,2008,23:47~49.酸氢二钠-柠檬酸缓冲体系中,修饰转化事剂/蛋白质配比的增加,使得蛋白质和修饰[2]杨成丽,郑迎迎,柯前进,李大力.人工略大于其它两种溶液。为继续考查离子强剂分 子的碰撞机会增大,从而促进了修饰型精氨酸酶基因的克隆及其在大肠杆度对对单修饰产物转化率的影响,选取了反 应的进行(见图4)。菌中的表达[J].化学与生物工程, 2007,5. 20.35mmol/L四个离子强度,发现单修饰综上所述,得到10kD聚乙二醇丙醛修饰24:53~ 55. .产物的转化率随着离子强度变化较小，20精 氨酸酶的优化修饰条件,即在4C下,在[3] Pool R.Hairy enzymes stays in themmol/L之后基本不变。2)蛋白浓度:蛋白浓20mmol/L, pH5.5的磷隐氢二钠-柠檬酸缓blood. Science， 1990,248:305.度对单修饰转化率的影响见图2.单修饰产冲溶液中 ,蛋白浓度为10mg/mL时,修饰剂/[4] Abuchowski A, Kazo GM，Verhoest物的转化率随着蛋白质浓度的增加而增大。蛋白摩尔配比为4:1的情况下,反应10h.该CR. Cancer therapy with chemically但是由于过高浓度下蛋白质很不稳定,容易种条件下,单修饰产物的转化率可达50%。modified enzymes. Cancer Biochem聚集沉淀，因此选择蛋白浓度10mg/mL作为Biopys, 1984,7(2):175~ 186.最佳反应条件(见图2)。3结语中国煤化工rmacopoeia, appendix 29.(3)反应时间。反应时间对修饰转化率本研究采用分子量为1000-armacopoeia Comittee,的影响见图3.单修饰和多修饰产物均随着聚乙二醇 丙醛对精氨酸酶进CNMHC民共和国药典2005版,附录反应时间的增大而增加，10h后,单修饰产讨了各修饰反应条件的影响,委员会, 2005.物的增加不加明显。反应到10h的时候,单反 应条件，即在4C下，在20mmol/L,pH5.5修饰产物的含量不再增加。因此,选择10h的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液中,蛋白浓92旁数据"gIENCE & TECHNOLOGY INFORMATION