镉对土壤脲酶动力学特征的影响

沈阳农业大学学报,201006,41(3):2099303Joumal of Shenyang Agricultural University, 2010-06, 41(3): 299-303镉对土壤脲酶动力学特征的影响张昀,可欣2,关连珠1*,颜丽1(1沈阳农业大学土地与环境学院,沈阳10866;2沈阳航空航天大学辽宁省清洁能源重点实验室,沈阳110136)摘要:采用室内模拟培养的方法,对镉污染土壤脲酶动力学特征进行了研究。结果表明:脲酶活性随着培养时间的增加而降低,并在第6天达到最大抑制率;同一培养时间内,随着镉浓度的增加,土壤脲酶活性呈现降低的趋势;两种模型拟合结果表明模型yrc(l+axy(14+bx)拟合效果较好,说明镉对土壤脲酶活性的抑制为部分抑制;随着镉浓度的增加K值不变,V-和V/K。呈降低趋势,说明镉对土壤脉酶的作用为非竞争型抑制,即抑制作用为部分非竞争型抑制。关罐词:镉;脲酶;酶动力学;土壤污染中图分类号:S1542文献标识码:A文章编号:1000-1700(2010)03-0299-05Effect of cadmium on Kinetic characteristics of soil ureaseZHANG Yun! KE Xin GUAN Lian-zhu* YAN Li'(1. College of Land and Environment, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China; 2 Shenyang AeroSpace University, Liaoning KeyLab of Clean Energy, Shenyang 110136, ChinaAbstract: The kinetic characteristics of soil urease were studied. The results showed that soil urease was remarkable inhibitedwith the concentration of Cd adding. While the maximum inhibtion ratio was attained in the sixth incubation day, the relationshipbetween the concentration of Cd+ and soil urease was described by two models, and the model y=c(1 +ar (1 +bx)was moresuitable. This means that the inhibtion of Cd on soil urease was part of inhibition. The K. was not effected, but the V andVK, were lowed while Cd adding. This results showed that the enzymatic reaction mechanism was noncompetion-inhibitorybetween soil urease and cadmiumKey words: Cadmium; soil urease; enzyme kinetic; soil contamination镉Cd)是危及人类健康的有毒重金属之一,在美国毒物管理委员会( ATSDR)黑名单上名列第六位常随着工业三废的排放及农药、施肥等农事活动进人到土壤生态系统中,并最终通过迁移、富集等过程进入食物链,对植物微生物、动物及人类产生威胁。我国土壤镉污染面积约为13300hm2,土壤镉含量在1-5ng·kg,最高可达10mg-kg。土壤酶是土壤中重要的生物大分子,作为养分循环、有机质形成、能量代谢等过程的催化剂,近年来被应用于土壤污染研究领域。由于土壤脲酶动力学特征不仅可以显示土壤脲酶含量的高低,而且反映了土壤脲酶与底物、土壤有机-无机复合体等之间结合的紧密程度和作用过程,因此被广泛关注吗。近年来,在污染物和抑制剂与土壤酶之间关系的研究中,土壤酶动力学方法已逐渐开始被采用,但关于镉对棕壤脲酶动力学特征影响的报道较少。因此开展此方面研究具有重要的理论和实际意义。本研究釆用室内模拟培养方法,对镉污染土壤的脲酶特征进行分析,以探讨二者关系及作用机理,为环境监测提供相关依据。1材料与方法11供试土壤供试土壤为典型棕壤采自沈阳农业大学天柱山田间试验区,为未受污染土壤,采样时先去除0~5cm表面土样,然后五点法釆集5-20cm土样,供试土壤均匀风干后挑除植物残体,过2mm尼龙筛备用。用常规方法测定土壤理化性质。供试土壤基本理化性质见表1中国煤化工收稿日期:2010-03-19CNMHG基金项目:辽宁省教育厅创新团队项目(20081151)作者简介:张畇(197-),女,沈阳农业大学讲师,博士研究生,从事环境土壤学研究。·通讯作者 Corresponding author:美连珠(1958-),男,沈阳农业大学教授,博士,从事土壤环境研究沈阳农业大学学报第41卷丧1供试士壤基本理化性质Table 1 Some physical and chemical properties of tested soil阳离子「机质交换量速效钾全氤全磷碱解氮有效确全量镉Avail.KTotal PCECs-Avail K Total NAvail P/gkg/g*kg/col.K/mg kg/mg·kg1.2方法将过2mm筛的土壤样品500g,装入培养钵中加水至田间持水量的65%,于28℃下培养1周,加入不同浓度的cdC2溶液,使土壤镉浓度分别为10,30,50,100,200 d".kg",于28℃恒温培养箱中培养,各处理均重复3次,每天称重以保持土壤含水量不变,并搅拌土壤,保持土壤通气性,分别于培养的1,3,6,10,15,30d进行取样分析,测定土壤脲酶活性吗。分别称取上述不同培养时间的土样500g,加入1mL甲苯15min后添加10mL不同浓度(001,0.025,0.05,0.1,0.2molL)尿素溶液和20mLpH67柠檬酸缓冲液,37℃培养,培养结束后,滤液中被脲酶水解成的氨氮用靛酚兰比色测定脉酶活性,并计算脲酶动力学参数。13模型的建立和数据处理131动力学参数的计算米氏方程:v=mSL式中:V为酶促反应初始浓度;v=为最大反应速度;S为底物浓度;Kn是为米氏常数。方程经过数学变换,变形为:用 Sigmaplot软件进行拟合即可求得K和V=。132模拟方程 SPEIR从米氏动力学方程推导出砷抑制土壤酶活性的两种模型:(1)y=/(1+bx)和(2)y=c(1+ax)(1+bx)(图1),可以用来拟合外源污染物(x)与土壤酶活性(y)之间的关系,两种拟合方程分别赋予其重要的信息,即反映的作用机理分别为完全抑制(包括完全竞争抑制或完全非竞争性抑制)和部分抑制(包括部分竞争抑制和部分非竞争性抑制)mac+c。b作用:其中a,b,c为在一定底物浓度下受到抑制常数K、最大反应速度和米氏常数以及抑制类型等共同作用下形成的复合参数,c为污染物浓度为0时土壤酶活性理论值,a,b,c均为正数,且b>d1。由两种模型的拟合方程可计算生态剂量( ecological dose,ED)EDo、ED、ED值,其分别代表土壤酶活性被抑制10%、图1分别用模型(1)-)和模型(2)(……表示土壤50%和90%时所需要的污染物浓度或剂量。通常人们将EDs酶活性(v)与污染物浓度(i)之间的关系作为土壤污染的一个临界浓度。由模型(1)计算的EDo为土壤 Figure 1 Relationships between enzyme(v)酶活性理论值(c)降低到50%时的污染物浓度,即ED=1;模 activies and inhibitor concentration (i)descri型(2)中土壤酶活性没有降低到0,而是降低到渐进值(平行于x轴,但在x轴之上),因此由模型(2)计算的EDs为土壤酶活性降低到理论值(c)与渐进值之间的一半时的污染物浓度,即ED=(1-ab)/(b-a)。13.3土壤酶活性的影响率的计算为了定量描述不同浓度镉对土壤酶活性的影响,采用土壤酶活性影响率对其进行描述土壤酶活性的影响率=CUYH中国煤化工CNMHG式中:U为各处理土壤酶活性3次重复平均值;U为对照(镉浓度为0mgkg4的处理)土壤酶活性为3次重复平均值。土壤酶活性的影响率包括两种:如果其值为正,则为激活率;如果为负,则为抑制率。第3期张昀等:镉对土壤脲酶动力学特征的影响2结果与分析襄2不同培养时间不同浓度镉处理土壤脲酶活性Table 2 Soil urease of different Cd concentrations in21镉对土壤脲酶活性的影响different incubation time由表2可见,在整个培养期间内对照处理的土壤脲酶活性 Soil urease脲酶活性无明显变化,添加镉的各处理脲酶活性3d6d10d均随着培养时间的延长呈现先降低后升高的趋势,并在第6天出现一个最低峰,各处理的土壤脲4.14C408E3013.854c455C454C酶活性分别为301,242,2.04,171,1,26μg·g同0003953.574242403.25:3963.96培养时间内,随着镉浓度的增加,土壤脲酶活性3.83301c204c3.I1k3.793.78呈现降低的趋势,到培养结束时,各处理的土壤脲27211.729183.283.28A酶活性趋于稳定262673.163.6注:小写字母表示p005水平差异显著大写字母表示p<001水平差异显2.2镉对土壤脲酶影响率的动态影响著同一列中相同字母表示各处理间差异不显著,不同字母表示各处理为了定量描述不同浓度镉对土壤脲酶活性的间差异显著。影响,采用土壤脲酶活性影响率对其进行描述(图 Note little letters indicated significant diference af005 level, big letters indi-2)。添加10,30,50,100,200mg·kg2镉的处理在试cated significant diference at 0.01 level, the different letters in same验培养期间内对土壤脲酶活性的抑制率分别为columns indicate significant difference between means.0.72%-42.09%,447%~52.24%,8.23%~60.88%培养时间Ineubation time d1146%-67.29%,1063%-7539%。且均表现为在第6天达到对土壤脲酶活性的最大抑制作用,不同浓度镉处理的抑制率分别为4209%、5224%60.88%、6729%、7539%,随后各处理土壤脲酶活性逐渐恢复。口10分别用模型(1)y=c(1+bx)和模型(2)y=c(130ax)(1+bx)两种模型进行拟合(表3),由拟合方程可口100计算生态剂量( ecological dose,ED) EDoEDs、ED值,其分别代表土壤酶活性被抑制10%、50%和图2不同浓度镉对土壤脲酶的影响率90%时所需要的污染物浓度或剂量。通常人们将 Figure2 The effect ratio of different Cd concentrations onEDx作为土壤污染的一个临界浓度。soil neutral phosphatase表3土壤脲酶活性与不同浓度镉的模拟方程Table 3 The fit models betweeen concentration of Cd and soil urease型参数培养时间 Incubation time/dModel模型(1)00069002700002700031y=c/(1+bx)4.080846934457214.56160927142986113050007100259001200122y=c(l+ar(1+bx) b4.70345.106451415485574.834709870.99208853.668中国煤化工332.397渐进值 Asymptote2296aL,.CNMHG7Z2 2.756注:*表示P0.05水平差异显著表示R001水平差异显著,渐进值为土壤酶活性译世为对于模型没有意义的数值Note:* indicated significant diference at 0.05 level, **indicated significant diference at 0.01 level, Asymptote values are presentde as maximum(unin-hibited)activity;-indicates no fit of the date to the model沈阳农业大学学报第41卷由模型(1)拟合的决定系数为0623-0927,而由模型(2)拟合的决定系数为0893~0992,模型(2)的决定系数大于模型(1)的决定系数模型(2)比模型(1)更能表示不同培养时间不同浓度镉与土壤脲酶活性之间相关关系。从侧面表明了镉对土壤脲酶的作用为部分抑制,其中包括部分竞争抑制和部分非竞争性抑制由模型(2)计算出的EDo值在5-263mg·kg之间,而由模型(1)计算出的EDs在37-1429mg·kg4之间,由模型(2)计算出的EDs明显小于由模型(1)计算出的EDsEDo值表征土壤受到了极为严重污染时的浓度,此时土壤已经基本丧失了生产的功能,由模型(2)计算出的ED为432mgkg2,此时,土壤就达到了极其严重污染的程度,从土壤生化角度来讲,土壤已经不能完成物质转化、能量代谢等功能。23镉对土壤脲酶动力学参数的影响在试验培养期间,各处理土壤脲酶的K值基本保持不变(表4),镉的加入并未使土壤脲酶的K。值增大无明显影响,并没有随着镉浓度的加大,土壤脲酶的Kn值增大,说明镉的加入没有影响酶与底物的亲和力减小,属于典型的非竞争性抑制。在试验培养期间,各处理土壤脲酶的V。值呈现升高-降低的趋势(图3a),并在培养的3-6d出现一个最高峰,镉加入使土壤脲酶的V。降低,并随着镉浓度的加大,土壤脲酶的V值逐渐减少,说明镉的加入,减弱了酶-底物复合体形成产物的能力。表4不同浓度镉处理在不同培养时间下K。值Table 4 Effect of different of Cd concentrations on soil urease K, in different incubation days镉浓度/ mg.kgd concentration0.03500340037峡100036003803300340.035M在试验培养期间,各处理土壤脲酶V。/K的变化趋势与V的变化趋势相似,即呈现升高-降低的趋势图3b),并在培养的3~d出现一个最高峰,镉加入使土壤脲酶的V-/K降低,随着镉浓度的加大,土壤脲酶的V。/K值逐渐减少,说明镉的加入,减弱了土壤脲酶在催促反应过程中的催化强度。ng·k图3不同浓度镉对土壤脲酶V和v。Kn的影响Figure 3 Effect of different of Cd concentrations on soil urease Va and V-K, in different incubation days3结论与讨论中国煤化工本研究结果表明,脲酶活性随着培养时间的增加而降低,THCNMH同一培养时间内随着镉浓度的增加,土壤脲酶活性呈现降低的趋势,这与胡著邦等的研究结果较为相似。目前国内外公认的重金属对土壤酶活性的抑制机理可能包括两个方面:一方面,重金属加入土壤后与酶分子中的活性部位巯基和含第3期张昀等:镉对土壤脲酶动力学特征的影响303·咪唑的配位体等结合形成较稳定的络合物,产生了与底物的竞争性抑制作用鸣;另一方面,重金属抑制了土壤微生物的生长和繁殖减少微生物体内酶的合成和分泌,最后导致土壤酶活性下降镉对土壤脲酶活性的抑制作用随时间的变化先增加而减小,可能与镉的形态转化有关,并且土壤具有保护酶的能力,且这种保护容量常是一相对恒定的值。也有学者发现“抗性酶活性”现象认为当重金属在土壤中达到一定浓度时,大部分微生物死亡而一小部分微生物在有毒物质污染下能生存下来,自行繁殖从而产生抗性酶活性,表观上酶活性值降低后又增大两种模型拟合结果表明模型y=c(1+ax)1+bx)拟合效果较好,说明镉对土壤脲酶活性的抑制为部分抑制。从土壤性质分析,由于土壤酶受到有机质和粘粒的保护作用,所以在一个较宽的污染物浓度范围内,其酶活性的变化一般不会总是以直线形式改变,而游离态酶有可能是以直线形式变化因此从这个角度来讲模型y=c(1+ax)(1+bx)计算得到的生态剂量更合理。随着镉的增加Kn值不变,V—和V。/K呈降低趋势,说明镉对土壤脲酶的作用为非竞争型抑制,即抑制作用为部分非竞争型抑制。研究表明,K。受土壤粘粒含量和有机质含量影响较大,一般粘粒和有机质含量高的土壤Kn较大,本研究中有机质含量和粘粒可以视为固定不变,由于V-值是总酶量的量度,其值减小说明重金属镉对脲酶活性的抑制作用习,从而进一步验证了前面的结论。参考文献[l]杨劲松张文昌镉对细胞信号转导系统干扰作用研究进展门福建医科大学学报,20064065}537-538[2] STUMM W, MORGAN J J. 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