胰高血糖素样肽-1在乙醇中的聚乙二醇修饰

第10卷第3期过程工程学Vol 10 No.32010年6月The Chinese Joumal of Process Engineering胰高血糖素样肽-1在乙醇中的聚乙二醇修饰王友傲1,翟艳琴‘,雷建都',马光辉',苏志国1(1.中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室,北京100190:2.中国科学院研究生院,北京10049)摘要:以乙醇为溶剂,单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯( mPEG-SO)为修饰剂,对胰高血糖素样肽-1(GLP1)进行了修饰反应条件的优化,同时对单修饰产物Mono- PEG-GLP-1进行分离纯化,并考察了其体外稳定性和体内活性.得77%采用冷冻离心方式对 Mono-PEG-GLP1进行初步分离和浓缩,然后经反相液相色谱进一步高效纯化,纯度可达97%以上体外实验表明, Mono-PEG-GLP1在血清中具有更好的稳定性及更强的抗胰蛋白酶消化能力.体内动物实验表明, Mono-PEG-GLP1具有更好的降血糖作用关键词:胰高血糖素样肽-1:单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯;聚乙二醇修饰;乙醇中图分类号:Q5143;R915文献标识码:A章编号:1009606X(201003-0593-051前言率需加入过量修饰剂(修饰剂与GLP-1摩尔比达21甚至5:1以上),易导致 Mono-PEG-GLP.1继续与胰高血糖素样肽-1( Glucagon-like Peptide-1,GLPl) mPEG-SC反应生成多修饰产物连接2个或2个以上聚是体内L细胞分泌的葡萄糖依赖性肠降血糖多肽激素,乙二醇链的修饰产物),造成修饰反应所得具有阻止胰腺细胞退化、刺激细胞的增殖和分化、促进 Mono-PEG-GLP的转化率较低,最多仅为50%胰岛素生成等作用.在2型糖尿病(Type2 Diabetes另一方面,由于修饰产物组分很复杂,含未修饰的Mellitus,T2DM治疗方面有良好的应用前景,成为近年GLP1、多修饰GLPl、单修饰GLP1及未反应的修饰来糖尿病治疗药物的研究热点但GLP1易被体内二肽剂等组分,虽然可用反相液相色谱分离,但修饰反应液基肽酶Ⅳ等酶降解,易被循环系统清除,半衰期很短是乙醇溶液,导致 Mono-PEG-GLP-I在色谱柱上不易吸(2min左右).另外,因具有免疫原性和抗原性,大大限附,因此不能直接将反应液上样,在采用反相液相色谱制了其临床应用14进行分离前需将反应液用超纯水稀释5倍,导致多次上蛋白质或多肽类药物的聚乙二醇[ Poly(ethylene样分离,增加了分离纯化的成本和时间,不利于放大制gyco,PG修饰技术是一种通过化学反应将蛋白质或备多肽分子与聚乙二醇大分子共价连接的技术,其突出优本研究以乙醇为反应溶剂,采用分子量5kDa的单势在于能降低药物的免疫原性和抗原性,减少循环系统甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯( mPEG-SC)修饰剂清除速率,从而有效延长药物体内循环半衰期现已有对GLP1进行修饰,考察了修饰反应条件对10种长效聚乙二醇药物经美国食品及药物管理局批准 Mono-PEG-GLP1转化率的影响.分离纯化过程中采用上市,取得了巨大的经济效益和社会效益56低温冷冻离心方法对修饰反应液进行预处理,在去除未目前主要采用修饰剂单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚修饰GLP1的同时获得高浓度的 Mono-PEG-GLP-1,进胺丙酸酯 [Monomethoxy Poly(ethylene glycol而结合反相液相色谱获得纯度高达97%的单修饰产物succinimidyl propionic acid esther),mPEG-SPA、单甲最后,考察了 Mono-PEG-GLP在血清中的稳定性、抗氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯[ Monomethoxy胰酶酶解能力及降糖效果Poly(ethylene glycol succinimidyl carbonate), mPEG-SCI进行GLP1的修饰研究,但还存在一些问题,如二者2实验易水解,在pH80、温度25℃条件下,其半衰期分别2.1实验材料与仪器仅有165和204min9为提高 Mono-PEG-GLP1转化胰高血糖素样肽-1(GLP-1)由北京中科亚光有限公收稿日期:201003-29,修回日期:201005-14基金项目:国家自然科学基金资助项目编号:20976179):国家高技术研究发展计划(863)基金资助项目编号:2007AA021604:2006AA10Z437)北京市自然科学基金资助项目(编号:2092027)作者简介:王友做(1986-),男,安徽省舒城县人,硕士研究生,生物化工专业:雷建都,通讯联系人,Te:01082623692, F-mail:jdei@ home. ipeac cn.过程工程学报第10卷司提供,分子量5kDa的mPEG-SC由本实验室利用进样量100μ通过软件计算GLP及mPEG活化而得,mPG( Polydispersity mPEG<1.08)Mono- PEG-GLP-1在色谱图上对应峰面积与初始峰面积购自美国 Union-Carbide公司,乙腈( Acetonitrile,ACN)、的比值,研究二者在大鼠血清中的保留行为三氟乙酸为色谱纯,购自北京 Dikma公司;乙醇、甘氨动物体内活性检测2:将体重300-340g的SD大酸为化学纯,购自北京化学试剂公司.实验用水为鼠随机分成3组,每组5只.实验前只给饮水,禁食过Millipore超纯水机制备的电阻率182Mncm的超纯水.夜,A组为空白对照,B组为GLP1对照,C组为实验用大鼠血清、SD大鼠均购自北京大学医学部实验 Mono-PEG-GLP1实验组.3组均腹腔注射葡萄糖18动物中心molko,A组腹腔注射生理盐水作为对照,B组腹腔注IC20AT高效液相色谱仪(日本 Shimadzu公司),射18 nmolkg GLP1,c组腹腔注射18 nmol/kg高速离心机(美国 Sigma公司)Mono-PEG-GLP-1.在0,5,60,150min时眼底取血,用2.2实验方法血糖仪测定血糖浓度PEG修饰反应:按一定摩尔比称取GLP-1与mPEG-SC,溶解于乙醇中,37℃反应一定时间,加入3结果与讨论过量甘氨酸终止反应3.1反应条件对单修饰产物转化率的影响Mono-PEG-GLP1的分离纯化采用岛津CBM20A聚乙二醇修饰中反应条件的控制是影响目标产物型液相色谱系统,色谱柱为C18反相色谱柱(250mmx含量的重要因素.目前关于有机相如乙醇中的聚乙二醇46mmLD),洗脱液A为超纯水+0.1%三氟乙酸,洗脱修饰研究报道较少,而GLP-l在乙醇中的修饰则未见报液B为乙腈∽0.1%三氟乙酸.反相液相色谱洗脱方法:道.为此,实验重点考察了 mPEG-SC与GLP-1摩尔比、0-5min35%B,5~25min35%55%B,25-30min35%B,GLP-浓度和温度对 Mono-PEG-GLP-l转化率的影响B液的梯度变化由色谱系统按程序直接完成,流速13.1.1 mPEG-SC与GLP-1摩尔比对 Mono-PEG-GLP1mL/min,检测波长280mm,进样量100μ.通过软件转化率的影响计算 Mono PEG-GLP-1峰面积占各组分吸收峰面积之图1是 mPEG-SC与GLP1摩尔比对产物转化率的和的百分比得 Mono-PEG-GLP-1转化率影响,表明 mPEG-SC与GLP1摩尔比较低时,采用岛津CBM-20A型高效凝胶液相色谱系统检测Mono- PEG-GLP-l转化率随摩尔比增大而升高;达到Mono- PEG-GLP.1纯度,色谱柱为 uperdexTM75,流定水平后,随摩尔比增大, Mono-PEG-GLP-1转化率呈动相为50mmo冮L磷酸缓冲液+100mmol几L硫酸钠+0.5%逐渐下降趋势.这是由于 mPEG-SC与GLP-1摩尔比越叠氮化钠,pH6.8,流速05 mL/min,检测波长280m.大,多修饰产物越易生成,从而降低了 Mono-PEG-GLP21l胰蛋白酶消化:按等摩尔比将一定浓度的GLP1转化率.因此选择 mPEG-SC与GLP1摩尔比为1进行和 Mono-PEG-GLP.1溶于20mmoL的磷酸缓冲液中修饰研究文献[8]在水溶液中采用 mPEG-SC进行的pH7.0),根据一定摩尔比加入胰蛋白酶,37℃孵育,GLP-1修饰, mPEG-SC与GLPl摩尔比需达21甚至分别在0,15,30,60,120min取样,置于4℃冰箱中终止更高,其 Mono-PEG-GLP.转化率仅为50%反应.用反相液相色谱检测反应物的残留量与加入量之比,考察胰蛋白酶对反应物的消化降解作用GLP1及 Mono-PEG-GLP.1的稳定性实验:将1mL大鼠血清加入20mL20mmo/L的磷酸缓冲液(pH74)中,配成血清缓冲液.纯化后的GLP1及Mono-PEG-GLP1按02mmoL溶于血清缓冲液,37℃孵育.定时取样,离心取上清液,用反相液相色谱进百行分析检测,色谱柱为C18反相色谱柱(250mm×4.6mmID),洗脱液A为超纯水+0.1%三氟乙酸,洗脱液0.8B为乙腈+0.1%三氟乙酸.反相液相色谱洗脱方法:0~5Molar ratio of PEG to GLP-1min35%B,5~20min35%50%B,20-25min100%B图1PEG与GLP1摩尔比对 Mono-PEG-GLP1转化率的影响25-30mi35%B,B液的梯度变化由色谱系统按程序直 Fig 1 Effect of molar ratio of PEG to GLP-I on the yield of接完成。流速1 mL/min,柱温35℃,检测波长280m,Mono-PEG-GLP-I第3期王友傲等:胰高血糖素样肽1在乙醇中的聚乙二醇修饰312GLP1浓度对 Mono-PEG-GLP.1转化率的影响3.2冷冻离心结合反相液相色谱对 Mono-PEG-础LP-1的在聚乙二醇修饰过程中,肽浓度对单修饰产物转化分离纯化率有重要影响,GLP-1浓度对 Mono-PEG-GLP1转化修饰反应结束后,反应液中除 Mono-PEG-GLP-1率的影响见图2.结果表明,低浓度时 Mono-PEG-GLP1外仍存在少量未修饰的GLP-1、多修饰产物及未反应的转化率随GLP1浓度增大而增大,到一定水平后, mPEG-SC.为此,对少量经甘氨酸终止反应的修饰反应Mono-PEG-GLP1转化率随GLP1浓度增大而逐渐减小.液用水稀释后采用高效反相液相色谱法进行分离,计算这是由于在高浓度下反应溶液中生成的多修饰产物多.Momo- PEG-GLP.1转化率.在C18色谱柱上GLP-保留因此GLP-1浓度取1mg/mL时间为152min,Mono- PEG-GLP-1保留时间为193313温度与反应时间对 Mono-PEG-GLP.1转化率的影响min,二者分离度大于2,分离效果好,结果见图4(a)在 mPEG-SC与GLP1摩尔比为1和GLP1浓度1和图4b但在制备Mono- PEG-GLP1时,由于修饰反mg/mL的条件下,考察了温度对 Mono-PEG-GLP-1转应液为乙醇,若直接上样 Mono-PEG-GLP-1,不易在反化率的影响,结果见图3.温度升高提高了修饰反应的相液相色谱的色谱柱上吸附.为此,需将反应液用超纯速度,Mono- PEG-GLP1转化率提高;但温度进一步升水稀释5倍后才能上样分离,这就需多次上样分离,增高,GLP1中的手性氨基酸的旋光性易发生变化而导致大了分离纯化成本和时间,实验中发现,活性降低,因此选择37℃作为修饰反应的温度.修 Mono-PEG-GLP.1、多修饰产物在乙醇中的溶解度随温饰反应进行24h后,Mono- PEG-GLP1转化率达到最大度降低而下降,因此采用低温冷冻离心方式初步分离值.因此选择温度37℃,反应时间24h.Mono-PEG-GLP.1,将反应液在4℃条件下高速(0000008GLP-1 concentration( mg/mL)图2GLP1浓度对Mono- PEG-GLP-1转化率的影响图3温度对 Mono-PEG-GLP1转化率的影响Fig 2 Effect of GLP-1 concentration on the yield ofFig 3 Effect of temperature on the yield ofMono-PEG-GLP-lMono-PEG-GLP-1Mono-PEG-GLP.1GLP-1图4GLP1、反应混合物和低温离心沉淀物的反相液相色谱图Fig 4 Reverse phase high performance liquid chromatography profiles of GLP-1reaction mixture and sediment of reaction mixture under frozen condition过程工程学报第10卷r/min)离心15min后,将上清液、沉淀分别进行检测,在大鼠血清中的稳定性及抗胰蛋白酶降解作用结果见表1,表明冷冻离心有效去除了大量未修饰3.31GLP-1及 Mono-PEG-GLP1在大鼠血清的稳定性GLP1,实现了修饰产物的预分离.将离心所得沉淀用GLP1与 Mono-PEG-GLP-1在大鼠血清中的稳定性水溶解后,采用反相液相色谱进行纯化,结果见图4(c),见图6,显示GLP-1在血清中很快被水解成无活性的收集 Mono-PEG-GLP-1[收集区间为图4(c)中GLP1(9-36)NH2,而修饰后的 Mono-PEG-GLP1的184-20.36min]后用高效凝胶液相色谱检测,结果见图稳定性显著增强,在血清中可长时间保持稳定,孵育135,单修饰产物纯度为97%,收率达95%以上h后仍保留90%,未发生明显降解,表明表1 Modified妣LP1和P1在修饰反应液、Mono-PEg-GLP-1比GLP1在血清中的稳定性显著提高离心沉淀和上清液中的含量332胰蛋白酶酶解稳定性检测Table 1 Modified-GLP-I and GLP-I contents in the reaction图7是GLP-1与 Mono-PEG-GLP-1胰蛋白酶酶解动力学曲线结果显示,酶解05h后,GLP-l在酶解反应液中仅有5%残留,而 Mono-PEG-GLP-1仍有23.6%Modifed-GLP-1(%,保留,这表明修饰后的GLP-1能显著增强抗胰蛋白酶降140解的能力Mono-PEG-GLP.11008000●- Mono-PEG-GLP1Elution volume(mL)图5单修饰产物的高效凝胶液相色谱检测图0005152Fig 5 High performance gel filtration liquid chromatographyTimeof purified Mono-PEG-GLP-l by reverse phase high图7胰蛋白酶酶解GLP1和Mono- PEG-GLP.1动力学曲线performance liquid chromatographyFig 7 Digestion kinetics of GLP-I and Mono- PEG-GLP-l in3.3体外稳定性检测yasin solutionGLP1无复杂的二级结构,极易被酶解而失去活3.4体内活性检测性,在体内的半衰期极短,仅2min.聚乙二醇修饰后,为了考察 Mono- PEG-GLP1与GLP1的体内活性,能否抑制蛋白酶降解就成了检定聚乙二醇修饰是否有将15只大鼠随机分成3组,按18 mmol/kg剂量给大鼠效的主要方式,因此对比了 Mono-PEG-GLP.1和LP1腹腔注射葡萄糖溶液,并定时观察老鼠的血糖变化,结果见表2.在给药150min后, Mono-PEG-GLP.1的降血糖效果明显优于未修饰GLP-1,结果见图8.由于GLP1在体内半衰期短,所以其促胰岛素分泌作用时间短,而mPEG-SC修饰后所得Mono- PEG-GLP1在体内的半衰GLP-1期大幅度延长,促胰岛素分泌作用时间长,因而降血糖ono-PEG-GLP-1效果更好表2P-1和 Mono-PEG叫LP1的降血糖效果比较(血糖浓度mo|/)Table 2 Effects of GLP-1 and Mono-PEG-GLP-l on plasma1012glucose homeostasis(blood ghsalino633±0.3424.28±0图6GLP1和 Mono- PEG-GLP1在大鼠血清中稳定性GLP-I6490451702±14511341078060.54Fig 6 Stability of GLP-I and Mono-PEG-GLP-l in rat plasma Mono-PEG-GLP-1 6.08#0.32 16.77:0.88 9.95+1.01 6.47#0.76第3期王友傲等:胰高血糖素样肽1在乙醇中的聚乙二醇修饰Glucagon-like Peptide-1(7-37)in Diabetic and Nondiabetic Subjects[3]Nauck M A, Wollschlager DGlucagon-like Peptide-1 (GLP-1 [7-36 amide) in Patients withia,1996,39(12)1546-1553[4]Arulmozhia D K, Porthab B, GLP-1 Based Therapy for Type DiabetesEur. J. Pharm. Sci,2006,28(1/2):96-108[5]Crawford J. Pegfilgrastim Administered Once per Cycle Reduces62(Sl):8989[6]Zhai Y Q, Zhao Y J, Lei J D, et al. Enhanced Circulation Half-life ofSite-specific PEGylated rhG-CSF: Optimization of PEG Molecular图8腹腔注射药150min后大鼠体内的血糖浓度Weight [] J BiotechnoL, 2009, 142(3/4): 159-166.Fig 8 Blood glucose concentration of the rats after[7]Lee S, Youn Y S, Lee S H, et al. PEGylated Glucagon-like Peptide-1drug injection for 150 minDisplays Preserved Effects on Insulin Release in Isolated Pancreatic结论lets and Improved Biological Activity in Db/Db Mice p]Diabetologia, 2006, 49(7): 1608-1611[8]张磊,翟艳琴,雷建都,等.胰高血糖素样肽1的聚乙二醇定点(1)以分子量5kDa的 mPEG-SC为修饰剂,在乙醇修饰[过程工程学报2009,9(6:1169-1173.溶液中进行GLP1聚乙二醇修饰,优化反应条件为:[9] Roberts M J, Bentley M D, Harris J M. Chemistry for Peptide andGLP-1浓度1mgmL,mPEG- SC/GLP-1摩尔比1:1,37℃Protein PEGylation [J]. Adv. Drug Del. Rev, 2002, 54(4): 459-476.[10] Zalipsky S, Barany G Facile Synthesis of a-Hydroxy-oo-反应24h.该条件下 Mono-PEG-GLP1转化率可达77%,carboxymethyipolyethylene Oxide. Bioact. Compat. Polym.远高于文献报道的水溶液中的转化率,且 mPEG-SC199052)27-231与GLP1摩尔比仅需1:1,降低了 mPEG-SC用量[ll迟玉石,黄文龙,张惠斌,等胰高血糖素样肽1类似物的合成(2)通过低温冷冻离心方法对 Mono-PEG-GLP1进12)ou1.cmi2H,LL,sa. Preparation and PEGylation of行预分离和浓缩,大大减少了后续分离纯化难度和工作Exendin Peptide Secreted from Yeast Pichia pastoris U]. Eur. J.量,结合反相液相色谱法实现了 Mono-PEG-GLP1高效Pharm Biopharm,2009,72(2):412-417纯化, Mono-PEG-GLP.1纯度达97%,收率达9%以上[13] Wang Y S, Youngster S, Grace M, et al. Structural and BiologicalCharacterization of PEGylated Recombinant Interferon Alpha-2b and(3 Mono-PEG-GLP1在血清中的稳定性远高于未Its Therapeutic Implications [] Adv Drug Del. Rev, 2002, 54(4)修饰GLP1,对胰蛋白酶有更好的抗酶解能力,比末修547-570饰GLP-1具有更好的降血糖作用[14] Senderoff R l, Kontor K M, Kreiigaard L, et al. Consideration ofConformational Transitions and Racemization during Process参考文献Development of Recombinant Glucagon-like Peptide-1 [] J[] Kieffer T J, Habener J F. The Glucagon-like Peptide [ EndocrinePharmacol sci.,1998,87(2)183-189Reviews,1999,205)876-913Modification of Glucagon-like Peptide-1 in Ethanol with Polyethylene GlycolWANG You-ao"2, ZHAI Yan-qin 2, LEI Jian-du, MA Guang-hui,SU Zhi-guo(1. State Key Lab. Biochem. Eng, Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, China,2. Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)Abstract: Glucagon-like peptide-l(GLP-l)was modified with monomethoxy polye(ethylene glycol succinimidyl carbonate) by usingethanol as a reaction medium. The reaction conditions were investigated and optimized, and the separation procedures of productMono-PEG-GLP-I were developed. After that, the stability in vitro and activity in vivo of Mono-PEG-GLP-l were investigated. Theoptimized reaction conditions were obtained as follows: concentration of GLP-1 1.0 mg/mL, molar ratio of PEg to GLP-1 1: l, andreaction time 24 h at 37C. Under the optimized conditions, the yield of Mono-PEG-GLP-l was up to 77%. The Mono-PEG-GLP-I waseparated from reaction mixture by a preliminary centrifugation under frozen temperature and successive purification by reverse phasechromatography. The purity of Mono-PEG-GLP-l was higher than 97%, as characterized by size exclusion chromatography. TheMono-PEG-GLP-l showed better stability in plasma, decreased proteolysis to trypsin and better activity in vivoey words: glucagon-like peptide-1; monomethoxy poly(ethylene glycol succinimidyl carbonate); PEGylation; ethanol