聚乙二醇修饰牛血清白蛋白的反应与分析

生物技术通i164LETTERS IN BIOTECHNOLOGY Vol.12 No.3 Aug.2001聚乙二醇修饰牛血清白蛋白的反应与分析'李伟军郑春辉张达磊张颖苏志国”(中国科学院化工冶金研究所生化工程国家重点实验室 北京10080)Q5|A摘要采用N，N'-羰基二咪唑活化法活化单甲氧基聚乙二醇 5000分子一端的羟基,对活化后的单甲氧基聚乙二醇分子进行了元素分析。用该活化产物对牛血清白蛋白的赖氨酸侧链氨基进行化学修饰。应用毛细管电泳对聚乙二醇修饰后的产物进行了分析,并与高效液相色诺分析结果作了对照研究,表明毛细管电泳对络饰后的牛血清白蛋白有更好的分析效果。关键词牛血清白蛋白.聚乙二醇。修饰，分析 ,毛细管电泳Modification of bovine serum albumin with polyethylene glycol derivative andrelated analysis techniquesLI Wei-Jun, ZHENG Chun Hui, ZHANG Da-Lei, ZHANG Ying, SU Zhi-Guo( Sate Key Laboratory of Biochemical Engineering，Institule of Chemical Mtallurgy.Chinese Academy of Scienes, Beijing 10080, P . R . China)Abstract Monomethoxypolythylene glycol (MPEG) was activated by N, N'-carbonyldimidazole. The activated MPEG was char.acterized by element analysis and used to modify bovine serum albumin (BSA). HPLC and capillary electrophoresis were appliedto analyze the modified products. Capillary electophoresis was evaluated站a convenient lcchnique in the analysis of MPEG modi-fied proteins.Key words bovine serun albumin, polyelhylene glycol, modication, analysis, capillary elecrophoresis随着生物技术的发展,蛋白类药物的应用越来饰可以有效降低牛血清白蛋白的免疫原性,修饰后越广泛。蛋白质属天然抗原，某些异源药用蛋白质的牛血清白蛋白可以作为血液代用品之一代替人血进入人体后会诱发抗体抗原反应而被清除,甚至会清白蛋白(HSA)(*.s。与传统的三氯均氰活化法相导致过敏反应。一些有治疗前景的蛋白质,在体内比,经N, N'羰基二咪唑(N, N'-carbonyldiimidazole,易被蛋白酶降解,存留时间太短,而达不到治疗效CDID)活化的PEC具有反应条件温和,被修饰蛋白果。研究表明,以聚乙二醇( polyethylene glycol,活性丧失较小，体内半衰期较长的优点6，1。我们PEC)、葡聚糖等大分子作修饰剂对蛋白质(多肽)的采用CDID活化单甲氧基聚乙二醇(MPEC),并用此某些氨基酸残基进行化学修饰,可以改善蛋白质的对牛血清白蛋白进行修饰。.药用性质,消除其免疫原性,延长在体内的停留时PEG是一类亲水的、有一定分子量分布范围的间,同时保持原有的生理活性"。因此,采用大分子电中性大分子化合物,其水力学半径较大.在溶液中修饰剂,对蛋白质分子进行特异位点的化学修饰的的形状不规则,这给PEG修饰蛋白质的分析分离带工作已成为生化药物研究的热点”,而PEG是蛋白来很大困难,迄今尚未确立- -种简便可靠的分析方质化学修饰中应用最广泛的大分子修饰剂之一法8)。毛细管电泳是近年发展起来的研究生物大分目前，一些重大传染病(如艾滋病.乙型肝炎)的子的新型手段,已被引人PEG修饰蛋白质的分析流行使人们不得不重新考虑异体输血和使用血液制中, PEC修饰蛋白质在毛细管电泳过程中按所联品过程中潜在的危险性，而开展血液代用品(bloodPEC个数的不同而依次分离19.101。我们采用毛细管substitute)的研兖是解决这一问题的有效途径'”。中国煤化工Inada等采用经三氯均氰(cyanunic chorde)法活化的0HCNMHG8)1助PEG对牛血清白蛋白(BSA)进行修饰,认为PEC修” 通讯联系入李伟军等:聚乙二醇修饰牛血清白蛋白的反应与分析电泳对PEG修饰的牛血清白蛋白进行了分离分析,仪。主机为Sysemn Gold Progannable Solvent Module 126 系统.并与HPLC方法作了对比。紫外检测器为BeckmanDiodeArayModule168.检测波长为280nm，反柑液相色谱柱为Beckman Ultrapore C, column, 4.6 mm x1材料与方法75 mm,采用System Gold专用软件系统处理数据。流动相为A:0.1%三氟乙酸水溶液;B:含0.1%三氟乙酸的乙脯.线性梯度洗脱.10%-90%B(30min).流速0.6m/min.经1.3步骤1.1 材料BSA购自中国科学院上:海生物化学研究所, MPEC购自处理后的样品可以直接进样.每次进样量为20 yuls .美国Union Catbide公司(相对分子质量5000+250),2,4,6-三1.7毛细菅电泳 分析采用美国Beckman公司P/ACE 5000毛细管电泳系统。电硝基苯磺酸( rnirtbenenenslufonire acid, TNBS)购自美闰Sigma泳缓冲液为0.05 mol/L磷酸缓冲液,pH2.5.使用前经超声波公司,CDID购自瑞七Fluka 公司。乙腈为美国Merck公司产徐气,经0.45 pum微孔滤膜过滤。普通熔融毛细管柱(河北水品。其它药品为分析纯。所有溶液均用RiOs超纯水系统年光导纤维厂)与自制线性聚内烯酰胺涂渍柱川总长均为27(Millipore.美国>生产的超纯水配制。cm,有效长度19.4 cm,内径50 pum。紫外检测器检测波长为1.2MPEC的活化称取MPEG 10g, CDID1.95g,溶于40 ml 1,4二氧六环200 mm,恒压操作模式,运行电压为10kV(+→-),柱温为25士0.1C。采用P/ACESation1.0电泳数据处理系统处理数中。待溶解后于37C下搅拌反应2h。F0下，向上述反应混合物中逐滴加人乙醚，并于滴加据。压力进样3.4474 kPa/3s。 每次运行前用电泳缓冲液冲洗过程中不断搅伴，所加乙醚约为40 ml。所得沉淀用C4漏斗过柱子3 min.实验结束后用超纯水冲洗毛细管柱5- 10 min,然滤,用乙醚洗涤3-4次,所得沉淀经真空干燥.得白色固体9.6后保存。经1.3步骤处理后的样品可以直接进样。g,即为CDID活化后的MPEG術生物(简记为CDIDMPEC)。2结果与讨论1.3 MPEG修饰蛋白质向2mg/ml的BSA溶液(pH8.5,0.05mol/L的borate缓冲2.1 MPEG 的活化与蛋白质修饰反应.液配制)中加入一定量的CDID-MPEG, BSA与CDID- MPEG的摩尔比例为1:60。将以上溶液混合均匀,置于4C下连续搅PEG有不同种类,-般采用相对分子质量5 000拌。72h后,将反应混合物在5000 r/min下离心I5 min, 以的单甲氧基聚乙二醇选择性修饰蛋白质分子赖氨酸AmiconSuredCell8200超滤器和截留相对分子质量为30000侧链的ε-氨基或N末端的a-氨基。的YM30超滤膜Millipore公司,美国)超滤除去小分子杂质，对所得的CDID-MPEG作C、H、O、N元素分析.超滤体积为反应体积的20倍。图1示MPEG的话化与修饰结果见表1。以元素N的实测含量与理论含量的相蛋白质的反应。对值表示MPEG的活化度,为82%。MPEG-OH + L，N(CDID)表1 CDID-MPEG的元素分析结果%尤素理论值实删值54.3753.24H8.988.036.0136.77MPEG-0(CDID-MPEG)ia0.550.4Protein-NH2-TNBS法测得MPEC修饰产物( MPEG-BSA)的修饰度为平均每分子BSA偶联4.8个MPEC。MPEG - -0N- Protein (MPEG Protein)2.2反相高效液相色谱分析MPEG-BSA采用C;反相高效液相色谱对MPEC-BSA进行圈1MPEC的活化与修饰蛋白质的反应了分析,结果见图2。天然BSA与被修饰BSA之间1.4 元素分析以元素分析法测定活化后的MPEG的C、H.0、N的百分的保留时间差异较大,但被修饰BSA不能再作进一含量。C.H.N的分析用CHN- Rapid元素分析仪(Heraeus,德步的分离。MeGoff等曾采用C4反相高效液相色国),0的分析用ST-02元素分析仪(北京分析仪器厂)。谱对MPEG-SOD进行了分析研究,本文结果与之相1.5 TNBS法测定蛋白修饰度类似。我们曾采用较缓的洗脱梯度,在70 min内将参照Hlabeeb的方法:"。中国煤化工:被修饰BSA作进--1.6 高效液相色谱分析片CN MH G缓冲液)与天然BSA采用美国Beckman公司System Golid多用途高效液相色谐之间的保留时间相差很近。图2中峰1.2.3对应的坐物技术通ifLETTERS IN BIOYTFCHNOILOCY Vol.12 No.3 Aug.2001保留时间分别为1.8 min.2 .0 min.17.3 minc标准""对图2中A谱图进行计算.衣明约有20%的BSA未被MPEC修饰(未被修饰的BSA可通过凝胶过滤除去,另文报道).而TNBS方法只能测定蛋白平均修饰度,不能判断残存大然蛋白的量与被修饰组分的数量分布。相比之下，毛细管电泳具有分析速度快(15 min内),定量准确,所需样品量少(进样量小于10nl/次)等特点,适于PEG修饰蛋白制品的质量控制,值得进-步研究..15t/min参考文献圈2 MPEC-BSA 的高效液相色谱分析围谱1.非保留组分: 2. 天然BSA组分: 3. 被修饰BSA组分王树歧.金晶.马淑哲。 蛋白质的化学修饰与生化药物.中国牛化药物杂志1998,19: 2242.3毛细管电泳分析MPEG-BSALundualad RL, Brnulshaw RA. Application of sie speeifir ehenical mod.采用毛细管电泳对MPEC-BSA进行分离分析,ification in the manuiecture of bophameaceuticals: 1. An overvien. Biv-technol Appl Biochero, 1997, 26: L43见图3。图3中A为采用聚丙烯酰胺涂渍毛细管柱Li W. Zhang D. Lin B. Su 7.. Purificat1on and dntification of PEGlet-进行的分离谱图,B为普通毛细管柱的分离谱图eed henoglobin. 0 potenial blood subeitute by eronstography and cup聚丙烯酰胺涂渍毛细管柱可有效地对MPEG- BSA混ilary eleoporesis. Chomalographia, 200 S2: 451Inada Y. Frukawa M, Sasaki H a al. Biomedical and biutechnological合物进行分离,而普通毛细管柱不能将MPEG-BSAapplications of PEG- and PM modified proteins. Trends Biotechnol .混合物分开。其原因是采用线性聚丙烯酰胺静态涂1995，13; 86柱法对毛细管内壁改性后,可有效减少蛋白在毛细5 Sasaki H, Ohtake Y, Matsushimm A et al . Reduction of immunoreactiv-ity of bwvine seum albunin corajugated with comb sharped plyethylene管壁的不可逆吸附,有利于提高分离度川。gyol dervatives. Biochem Biophys Res Conmun. 1993. 197: 287Beuchamp co, Gonia sL, Menepace DP el al. A new procedure ferthe syntheis of polythylene gyeol-procin adducts: eftets on function,receplor reoguition, and clearance of superoxide dsnutase. lacofemin.and a2- macroglobulin. Anal BRiochem. 1983. 131; 25KajiharaJ, Shibeta K, Nakano Y es al. Physicheraicat characteiza.|Ption of PEC PPG eonjugated human uroknse. Biorhim Riophys Acta.1994，199: 202Roberts MJ, Harris JM. Attachnent of degnadable pouly( ethylene glycul)CDIDto proteins has the potential to increse therpeuir eficucy. J PharmSei, 1998. 87: 1440Bulock J, Chowdhury s, Severdia A eal. Comparison of resuls of v归-20rious methods used to determine the exlent of modifieation of methoxypolyetbylene glycol 5000 modified bovine euprie-zine superoxide dig-图3 MPEC-BSA 的毛绷臂电泳圈谱mutase. Anal Bixchem. 1997, 254: 254A.徐溃毛细管柱; B.普遁 毛细管柱.10 Li w. Zhong Y, Lin B. Su z. Characterization of plyethylere glyrol.mdied proteing by senu- squcous epllay eoporsis. J Chroma-P。为天然BSA;P、P2. P分别表示偶联有1.2.3↑个togr A. 2001, 905: 299MPEG分子的BSA:CDID为N. N'羰基二眯唑1 Habeeb AFSA. Deternination of free anino groups in protcine by trimi-通过内标法可知P。为未修饰的BSA,修饰产物trobenzenesulfonie ncid. Anal Biochem. 1966. 14: 3282 HanF, XueJ, Lin B. Manitoal inluence on the separation DNA frag-中残留-部分游离的CDID.实验过程中,曾将活化ments by capillary leetrphoresis in eniangled polymer sultions。Talan-的CDID-MPEC以及未活化的MPEG进样电泳,在此u, 1998, 46: 735条件下30 min内仍不出峰,说明这两种物质不会干13 MeCoff P, Baziokis AC. Maskiewier R. Andlyis of polyethylene gkjyculmodified uperoxide disnulse by chromatographie. ertophuretie 。扰实验结果。light sattring. chenical and enzymoetie methols. Chem Pharm Bull. ,毛细管电泳谱图(图3A)显示的蛋白修饰度显1988. 36: 3079然比TNBS测定值低。Bullock 等已报道过这一差中国煤化工: manal. Flere:: Rrk.异,认为MPEG活化行生物本身的亲核性会使TNBSfYHC N M H G2001:02.23收稿>测定时的结果偏高|9。我们以校正峰面积作为定量