甲氧基聚乙二醇修饰改造RhD(+)血型的初步研究

654●中国实验血液学杂志Journal of Experimetal Hemaology 2003; 11(6):654 - 658文章编号(Aricle ID):109 . 2137(2003)06 - 0654- os.●论著.甲氧基聚乙二醇修饰改造RhD( + )血型的初步研究李立立，王捷熙,檀英霞,章扬培军事医学科学院输血研究所,北京100850摘要Rh血型与ABO血型-样是重要的血型 系统, Rh血型不符会引起严重的输血反应及新生儿溶血病。中国.人群中RhD阴性血型的比例仅为0.2% - 0.5%,将RhD阳性红细胞改造成RhD朗性红细胞在临床输血中有重要的意义。本研究用4种不同端基的甲氧基聚乙二醇(mPEG),修饰A型.B型.AB型和o型的RhD(+ )红细胞,比较4种mPEG衍生物对RhD抗原的修饰效果。同时观察mPEG修饰对红细胞形态结构和功能的影响。结果表明，mPEG BTC(苯并三唑鸡基PEC)较其他3种PEG的修饰效果好,在1 mmol/L时可以有效地遮藏红细胞表面RhD抗原,而对红细胞形态渗透脆性、自身溶血、乙酰胆碱酯酶、胆因醇、ATP.2, 3-DPG;含量以及变形性无影响。结论:初步实现了将RhD( + )红细胞修饰改造成RhD( - )红细胞的目的。关键词甲氧基聚乙二醇; RhD血型;血型改造中團分类号R457.11文献标识码Preliminary Study on Conversion of RhD Positive Red Blood Cells to RhDNegative by Modification with Methoxy Polyethylene Glycol1.I LiLi, WANG Jie-Xi, TAN Ying Xia, ZHANG Yang-PeiInstinte of Blood Transfusion, Academy of Military Medical Sciences, Bejing 100850, ChinaAhstractRh is a very important blood group like ABO blood system in transusion mdicine. It causes severetransfusion reaction and hemolytic disease of the newbom (HDN) if RhD blood group does not match between the donorand the reipient. The population of RhD negative is only about 0.2%一0. 5% in Chinese. Conversion of RhD pesitiveRBCs to RhD negative is very important in clinical transfusion. This study was to try to modify RhD antigen located onthe surface of A, B,0 and AB red blood cells in order to convert RhD positive to RhD negative by the modification of fourkinds of methoxypolyethylene glycol ( mPEG) derivatives and to observe the effect of mPEG modification on cellmorphology，structure and function. The result demonstrated that modification fficiency of mPEG-BTC ( mPEG-benzotriazole carbonate) was better than other three kinds of mPEG derivatives. It could camouflage RhD antigenefficiently when the concentration reached to 1 mmol/L. The result also showed that there were no harmnful efs ofmPEG modification on cell morphology, asmotic fragilty, hemolysis, AchE, cholesterol, ATP, 2, 3-DPG anddeformability. It is suggested that succes in convering RhD positive RBCs to RhD negative was preliminarily achieved.Key words nethoxy polyethylene glyool; RhD blood group; blood group conversionJ Exp Hemaol 2003; 11(6):654 - 658Rh血型系统自1939年被发现以来,因导致新生儿.萨克族、锡伯族、乌孜别克族和柯尔克孜族中，Rh阴溶血病(HDN)、溶血性输血反应而成为红细胞中仅性约占5%,高于国内其他民族;而汉族人Rh阴性次于ABO血型的重要血型系统。Rh血型系统主要仅占0.2% -0.5% 2]由此可以看出,我国汉族人抗原有RhD, RhCe, RhEe, 其中RhD抗原性最强，Rh阴性血的比例远小于白种人和黑人。Rh阴性血50% - 75% Rh阴性个体通过输血和妊娠,可受D的供应长期存在不足,在出现大量伤员(如灾害、战抗原红细胞免疫而产生抗D。给RhD阴性人输用争)及一些大型的国际交流活动(如奥运会.世博会)D阳性血200ml,85%产生抗D"。如果将RhD阳时,对Rh阴性血的需求会大大增加。因此,将RhD性血输给已产生抗D的人,可能产生危及生命的溶(+ )血改造成RhD(- )血有重要的政治、军事意血性输血反应。义。Rh血型中的D抗原具有较大的临床意义,因此在常规检查中一般只鉴定RhD阴性和阳性。在基金项目:国家973课题，编号202CB713804白种人中, Rh阴性约占15%;在黑人中约占4%;在通讯作者;章扬培,教授,博土生导师.电话: (010)66931545. Enail: zhaneyp@nic.' bmi. a. cn蒙古人种中不到1%。居住在新疆的维吾尔族、哈2003中国煤化工YHCNMHG甲氧基聚乙二醇修饰改造RhD(+ )血型的初步研究在本课题中研究了4种携带不同端基的甲氧基mPEG修饰对红细胞结构功能的影响聚乙二醇(mPEG)对RhD( + )血型抗原的修饰效果取mPEG修饰前后的红细胞, 37保温48小时,检及其对红细胞形态、结构、功能的影响,以期将RhD测上清液在540nm处的光吸收值,计算红细胞的(+)改造成RhD(-),从根本上解决临床输血对自身溶血率;红细胞悬液10 μl加入1.25 m!的RhD( - )血型红细胞的需求。0.32%-0.64%的NaCl梯度溶液,判断红细胞的渗透脆性是否发生变化;乙酰胆碱酯酶(AchE)活性材料与方法用微量羟胺比色法检测;异丙醇氯仿抽提红细胞膜脂质，胆固醇与FeCl,可生成紫红色胆固醇~铁复合血液标本采A型RhD(+),B型RhD(+),AB型RhD(+),0.物，在560nm处比色,确定红细胞膜胆固醇含量;型RhD( + )志愿献血者外周静脉血,肝素抗凝,生红细胞ATP用试剂盒(Stock no. fl-asc blolumines-理盐水洗旅,获取红细胞, CPDA-1保存液4C保存。cent somatic cell assay kit, Sigma) 测定;红细胞2, 3-DPG含量用试剂盒(Diagnostics, 2, 3-dpg, proce-不同端基PEG衍生物dure no. 665, Sigma) 测定;红细胞悬浮于4%聚乙烯mPEG BTC( mPEG benzotriazole carbonate)(苯并三吡咯烷溶液中,用红细胞变形仪(techiconekta.唑端基PEG)(20 kD); mPEG ALD (mPEG propi-cytometer)测定红细胞变形性。onaldehyde)(丙醛端基PEG)(20 kD); mPEG2-NHS统计学方法(mPEG2-N-hydroxysuccinimide) (N羟基琥珀酰胺应用SAS6.0统计软件进行方差分析,数值以平均酯端基PEG)(20 kD); mPEG-MAL( PEG maleim-值土标准差(元士s)表示。ide)(马来酰亚胺端基PEG)(20 kD)。上述衍生物均购自Shearwater公司(USA)。结果PEG修饰红细胞生理盐水洗涤红细胞3次,用PBS等渗液(pH 8.0)mPEG修饰红细胞RhD抗原性调整压积到12%。加入不同浓度mPEG,其中人RhD(+)的A型B型、AB型和0型红细胞与抗mPEG BTC(用pH 8.0的PBS溶解)终浓度分别为_D单抗反应发生凝集。mPEG BTC修饰后的红细0,0.2,0.5, 1.0 mmol/L, 25C反应1小时; mPEG-胞随着mPEG浓度增加,凝集反应逐渐臧弱,依度ALD(用pH 8.0的PBS溶解)终浓度分别为0,0.5,达到0.5 mmol/L时与抗_D单抗反应消失。mPEG-1.0, 3.0 mmol/L,并加入占反应体积1:10的硼氰化ALD, mPEG2-NHS, mPEG-MAL虽然随着浓度增钠(NaCNBH3), 25个分别反应1, 6, 12小时;加，凝集反应也逐渐减弱,但直到4.0, 6.0 mmol/LmPEG2-NHS(分别用pH8.0的PBS和pH8.0的.时,凝集反应仍未完全消失(表1)(显微镜观察xHEPES溶解')终浓度分别为0,2,4, 6 mmol/L,10),提示mPEG BTC对RhD( + )的修饰效果最好,25C和4C分别反应1, 6, 12小时;mPEG-MAL(pH可以有效遮蔽RhD(+)抗原，将RhD(+)血型改造8.0的PBS溶解)终浓度分别为0, 2, 4, 6 mmol/L,成RhD(- )血型。25C和4C分别反应1,6,12小时。反应完后,用生抗_D单抗( Immucor, USA)为IgM类抗体,而理盐水洗涤3次,并调整压积到45%,4C放置。天然的RhD抗体为IgG类抗体,用IgG类抗ID多mPEG修饰对红细胞RbD抗原性的影响克隆抗体( Immucor, USA)及羊抗人lgG( Immucor,mPEG修饰红细胞后对红细胞RhD血型抗原的遮USA)与上述0.5, 1.0 mmol/L mPEG-BTC修饰的蔽效果通过凹形血型鉴定卡、间接抗人球蛋白实验红细胞及对照组红细胞进行间接抗人球蛋白(IAT)(IAT)来检测(1。实验,以检测修饰后的红细胞表面是否还存在弱滴度的RhD抗原。显微镜观察(X 40)说明, 0.5mPEG修饰对红细胞形态的影响在显微镜下观察mPEG修饰红细胞。用戊二醛固mmol/L时仍有凝集发生, 1. 0 mmol/L时无凝集。.定红细胞,原子力显微镜( SPM-9500J3, SHIMAD-这表明经1.0 mmol/L mPEG-BTC修饰的红细胞表面已检测不出RhD抗原(图1)。zU, JAPAN)观察红细胞形态S。中国煤化工MYHCNMHG656中国实验血液学杂志J Exp Hemutol 2003; 11(6)Table 1 Comparison of the mditication efets of four kindsmPEG on RhD antigenmPEG对红细胞结构功能的影响mPEGreaction conditionconcentration对mPEGBTC修饰后的红细胞进行结构功能检测(mmoVL)Anti-D表明:修饰前后,红细胞的渗透脆性、自身溶血、乙酰胆碱酯酶活性、胆固醇含量、ATP、2, 3-DPG以及变mPEG-BIC25t 1h4+pH 8.0 PBS dsolutio0.2+形性均无显著改变,说明mPE(- BTC修饰对红细胞的结构及携氧功能、变形力没有影响(表2)。0.51.00讨论mPEG-ALD 25T 1- 12h"0.PEG的基本结构是HO (CH2(H2O)。CH、CH2OH,plI 8.0 PBS disolution是一种无毒、低免疫原性的化合物，可用于体内,NacCNBH3PEG修饰的白蛋白己经被美国FDA批准用于临mPEG2-NIS 25t: 1- 12h'床[6]。Jeongh'" 及Hortinl 等在1996年首次报道pH 8.0 PBS dssolution了将PEG用于修饰红细胞以遮蔽红细胞表面血型σr4C 1-12h"抗原。随后,不少作者进行了PEG修饰红细胞的实pH8. 0 IEPES dssdus验[9 14)。 大部分实验结果表明PEG修饰红细胞以mPEG2-MAL 25t 1- 12h'后,可以遮敞红细胞的血型抗原。Hortin["4I 和Hu-pH 8.0 PBS dssalutioangl5]的实验表明，红细胞经过修饰以后在小鼠体or4C 1- 12h*内的存活时间减短,红细胞离心容易破碎及溶血。pH8.0 PIS dsuionnFisherl31的实验又显示PEG修饰后并没有完全遮蔽红细胞的血型抗原。作者的实验室曾用氰脲酰氯* ; 12 hours incubation resulus. 4 + : complete agglutinabiliy. 2 +50% aglulinabiliy. 1 + ": less than 5% aglutinobility. 0: no agglu-活化的PEG(C-mPEG)(5 kD)修饰AB型RhD( + )tinabilits红细胞,当CmPEG浓度达到12. 0 mg/ml时，红细胞抗原性大大减弱,形态、结构.功能不受影响,但浓mPEG修饰对红细胞形态的影响度较高会使小鼠红细胞寿命明显缩短"61。1.0 mmol/L mPEG-BTC修饰红细胞形态正常,进一为了降低修饰红细胞所需的浓度,寻找更适合步用原子力电镜观测mPEG-BTC修饰的红细胞呈用于人体的PEG,我们选择了mPEG-BTC, mPEG-典型的双凹圆盘状(图2)。0 mmol/L0.5 mmoLL1.0 mmol/L.Figure 1 IAT test of mPEG-BTC-modifhed RhD(+ ) RBCs中国煤化工MHCNMHG甲氧基聚乙二醇修饰改造RhD( + )血型的初步研究657●的1010201.00001博00.001.期017開D网INm 5相明0.000 mmol/L1.0 mmol/LFigure 2 Morphology of RBCs before and after mPEG-BIC moditication obsered by Atomic Force microscopeTable2 Eftetes of mPEG-BTC modincation on cell sructur, function and deorombillyParameter0 mmol/I.0.5 mol/L1.0 mmol/I.Osnotic fraglit( %)0.460.44Hemolysis( %)2.45士0. 377#1. 91 +0.0361. 52+0.071AchE( umol)0.754土0.0220.789土0.0570.782士0.146Cholesterol° (%)100110.33+ 18.23103.73土15.736ATP( x 10-8 mo/50 μl RBC)2.55+0.211.72+0. 19.2.04土0.252,3-0PG*(%)110.72土13.9599.43+5.89 .DhMux0. 6413 t 0.0170.6852土0.0070.6607 t 0.025#: Nornal range +SD. * : Relative contentAI.D, mPEG2- NHS, mPEG MAL,其中mPEG-BTC验结果说明mPEGBTC修饰对红细胞结构和功能与红细胞膜上的氨基反应,形成氨基甲酸酯的稳定均无影响,我们初步实现了将RhD(+)血改造成连接;mPEGALD是醛基的mPEG術生物,与胺类RhD( - )血型的目的。反应; mPEG2-NHS 是分枝的mPEG衍生物;mPEGMAL与红细胞膜上的巯基反应。4种参考文献mPEG衍生物分子量均为20 kD。实验表明, 4种不.同端基的mPEG以mPEGBTC遮蔽红细胞表面. 李勇,杨贵珍. RH血型系统.见李勇,杨贵珍主编.人类红RhD抗原的效果最好，可将RhD( + )红细胞改造成细胞血型学实用理论与实验技术.北京:中国科学枝术出版社，1999:73-92RhD(- )。我们还对mPEG BTC修饰的红细胞进行了形2赵桐茂RH血型.见赵桐茂主编.人类血型遗传学。北京;中国科学技术出版社, 1987:91- 109态及结构功能的检测。滲透脆性、自身溶血和胆固醇指标反映了红细胞膜完整性。其中渗透脆性是观3 Hortin GL, Iok HT, Huang sT. Progres towerd preparation ofuniversal donor red cells. Arif Cells Blod Substit Immcbi Biotcch.察红细胞在不同浓度盐水中的溶血程度,判断其对nol, 1997; 25: 487 - 491低渗盐水的抵抗力，与红细胞表面积和体积比值有4童军,杨明.红细胞血型鉴定.见李勇,杨贵珍主编.人类红关;自身溶血说明红细胞膜是否有缺陷,如果膜缺陷细胞血型学实用理论与实验技术.北京:中国科学技术出版社,会表现为溶血程度增加;胆固醇含量是膜的流动性1999:279 - 288的重要指标,胆固醇含量增加则膜流动性降低;ATPs Ouerghi O, Toohani A, Othnane A. et al. Investigting specilice和2,3 DPG是红细胞代谢中间产物,也是反映RBCantigen/antibody binding with the atormic force microscope. Biomol携氧能力最重要的指标;DImx反映红细胞的最大变Eng, 2002; 19:183- 188形指数,说明红细胞变形通过毛细血管的能力。实5 Se中国煤化工er b sbsiurte amYHCNMHG658●中国实验血液学杂志J Exp Hemaol 2003; 11(6)tigenically inert erythroeytes. In: Winslow RM，Vandegriff KD,tional consequences of antigenic modulation of red cells with me-Intagletta M (eds). Advances in Blood Substitutes: Industrial Opthoxypoly (ethylene giycol). Blood, 1999; 93:2121 - 2127portunities and Medical Challengcs. Boston: MA Birkhauser, 1997:133-15012 Scott MD, Murad KL, Koumpours F, et al. Chemicel eamoulgeof antigenic detemninants: tealth erythrocytes. Proc Natl Acad Sxi7 Jeong ST, Byun SM. The derase of egutinablity of buman ABUSA, 1997; 94:7566 - 7571type red blood cell by attechment of methoxy-polyethylene glyool.Art Cells Blood Substit Immobiol Biotechnol, 1996; 24: 358 (ab-13 Fisher TC, Arnstong JK, Miselman HU, et al. Polyethylene gly-col coating of red blood clls strongly inhibis agglutination but doesnot produce clls that are antigenically "slient" Transfusion, 1997;8 Hortin GL, Lok HT, Huang sT. Progress toward preparation of37: 885 (abstract)universal donor red ells. Artif Cels Blood Substit Immobil Biotech-nol, 1996; 24:351(abstract)14 Hortin GL, Huang ST: Surface-pegylaied red cells as potential uni-versal donor red cll. 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