杜仲叶乙醇提取物的降糖作用机理

※营养卫生品科兽2014V.35,No.17197杜仲叶乙醇提取物的降糖作用机理张红霞,杨丹丹,王凤,李伊娇,范俊峰(北京林业大学生物科学与技术学院,北京100083)摘要:为了阐明杜仲叶的降血糖功效及其机制,采用酶抑制剂模型,筛选高抑制率的杜仲叶乙醇提取物并判断其对α-葡萄糖苷酶的抑制类型;借助caco-2人结肠腺癌细胞模型,研究杜仲叶20%乙醇解吸物对α-葡萄糖苷酶活性及葡萄糖转运蛋白的影响;气相色谱质谱联用分析杜仲叶20%乙醇解吸物主要成分。杜仲叶20%乙醇解吸物可竞争性地抑制a葡萄糖苷酶,其抑制常数K值为3290mg/mL。它对Caco-2细胞中的a-葡萄糖苷酶有较强抑制作用,其ICs为0.57mg/mL,且对Cac-2细胞摄取葡萄糖也有一定抑制作用,1mg/m时抑制率可达2625%。气相色谱质谱分析表明杜仲叶20%乙醇解吸物主要有DL异柠檬酸内酯、百里酚、儿茶素、2,6-二羟基苯甲酸和3,4-羟基苯丙烯酸等。这些结果表明,杜仲叶乙醇提取物可以通过抑制a-葡萄糖苷酶活性,降低葡萄糖吸收来实现降血糖的效果。关键词:杜仲叶;Caco-2细胞;α-葡萄糖苷酶;降血糖;葡萄糖转运:儿茶素Ethanol Extract of Eucommia ulmoides Leaves Inhibits Alpha-Glucosidase in Caco-2 CellsZHANG Hong-xia, YANG Dan-dan, WANG Feng, LI Yi-jiao, FAN Jun-fengCollege of Biological Sciences and Technology, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China)Abstract: The inhibitory effects of 40% ethanol extract of Eucommia ulmoides leaves on alpha-glucosidase and glucosetransport were investigated in Caco-2 cells in vitro to elucidate the anti-hyperglycemic mechanism of Eucommia ulmoideleaves. The alpha-glucosidase inhibitors in the ethanol extract were also identified by GC-MS analysis. The kinetic studyshowed that the 20% ethanol elution fraction(EEB)from macroporous resin AB-8 of the ethanol extract of Eucommiaulmoides leaves could competitively inhibit alpha-glucosidase with a K, value of 32.90 mg/mL, indicating that alphaglucosidase has a strong affinity with the extract. Meanwhile, the inhibition was found to be reinforced as the concentrationof EEB increased. For investigation of the inhibitory effect of EEB in Caco-2 cells, cytotoxicity assays were firstly conductedby using different concentrations of EEB (0.05, 0.10, 0.20, 0.50 and 1.00 mg/mL)to determine the safety level at which cellgrowth and viability could not be affected. All tested concentrations of EEB had no effect on the growth or viability of Caco-2cells. Subsequently, EEB at various concentration exhibited effective suppression on alpha-glucosidase by using maltose(28 mmol/L) as the substrate in Caco-2 cells in a concentration-dependent manner with an ICs of 0.57 mg/mL. FurthermoreEEB could also attenuate glucose transport in Caco-2 cells, which could be decreased to 26. 25% by EEB(1 mg/mL).Theseresults indicate that EEB exerts strong anti-hyperglycemic effect by suppressing disaccharidase and glucose transportorsGC-MS analysis was conducted to elucidate the composition of the ethanol extract of Eucommia ulmoides leaves. It wasfound that acids, monosaccharides, polyphenols, esters, amino acids were the main components of EEB. Further analysis byGC-MS revealed that the ethanol extract was rich in DL-isocitric acid lactone, thymol, catechin, 2, 6-dihydroxybenzoic acidand 3, 4-dihydroxy cinnamic acid. These compounds may play important roles in the hypoglycemic effect of the extract.Thepresent study suggests Eucommia ulmoides leaves are a medicinal food material for preventing and treating diabetes,andcould be further developed into healthful productsKey words: Eucommia ulmoides leaves; Caco-2 cells; a-glucosidase; hypoglycemic; glucose transport; catechin中图分类号:TS2521文献标志码:A文章编号:1002-6630(2014)17-019707doi:10.7506spkx1002-6630201417038收稿日期:2013-11-03基金项目:国家自然科学基金面上项目(J103516)作者简介:张红霞(1988-),女,硕士研究生,研究方向为功能性食品。E-mail:Luludeert305@sina.cn*通信作者:范俊峰(1970—),男,副教授,博士,研究方向为植源性多肽和黄酮的抗血栓、抗糖尿病功能。1982014,.35,No.17自品科字※营养卫生糖尿病已被列为继心脑血管疾病、胂瘤之后的第三细胞北京协和医院;MEM培养基、胎牛血清美国大致死性疾病凹。碳水化合物在人体内必须经由α-葡萄 Gibco公司;96孔培养板、24孔培养板、细胞培养瓶、糖苷酶水解其α-1,4糖苷键,生成葡萄糖、果糖、半乳糖磷酸盐缓冲液( phosphate buffered saline,PBS)、胰蛋后才能被小肠吸收。因此通过抑制a葡萄糖苷酶活性,白酶美国 Hy Clone公司;阿卡波糖拜耳医药保健可延迟或阻碍多糖在消化道内水解,以降低人体血糖浓有限公司;麦芽糖(分析纯)北京化工厂:葡萄糖试度,可有效防治糖尿病。a-葡萄糖苷酶抑制剂,已第剂盒上海超研试剂有限公司:N,O-双(三甲基硅烷3次被亚太地区糖尿病治疗药物指南推荐为降餐后血糖的基)三氟乙酰胺(MObs( (trimethylsi) trifluoroacetamide,线药物。a-葡萄糖苷酶抑制剂越来越成为近年来药物 BSTFA)、三甲基氯硅烷( trimethylchlorosilane,TMcs)化学的研究热点。上海安普仪器试剂公司。杜仲( Eucommia uLmoides oliver)是药理性质很强的中药材,杜仲有降血压、提高免疫力、抗衰老、补12仪器与设备肾、强筋健骨等作用6。同时,杜仲也是中国传统的药LL-1500真空冷冻干燥机赛默飞世尔科技有限公食同用的保健食品,以杜仲鲜叶为原料炮制而成的杜仲司; GC/MS-QP2010A气质联用仪日本岛津公司;CO2茶可减少体内多余脂肪和胆固醇,在东亚非常流行。细胞培养箱日本 Yamato公司;超净工作台苏州医杜仲制成的杜仲晶、杜仲粉等都有一定的保健功效疗器械仪器厂;ST-360酶标仪上海科华实验系统有限最近研究表明杜仲叶具有降血糖作用,杜仲分离得到公司;倒置显微镜日本 Olympus公司。的黄酮醇糖苷可抑制糖化作用,作用可以与氨基呱相13方法媲美1;杜仲叶水提物对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠1.3.1杜仲叶乙醇提取物的提取及纯化有一定的降血糖作用山;杜仲茶甲醇抽提物可有效抑制杜仲叶洗净烘干粉碎,过20目筛,40%乙醇溶液为a-葡萄糖苷酶活性,维持体内适当的血糖值。但是,提取液,料液比1:60(m/V),浸泡25h后,每次超声提目前对杜仲叶降血糖的研究大多停留在化学成分分析、取1h,重复提取2次,合并滤液,用旋转蒸发仪浓缩后降糖效果上,针对其在人体内降血糖机制尚不清楚。冷冻干燥,备用"本实验借助Caco-2人结肠腺癌细胞模拟人体小肠壁将所得样品配制为质量浓度5mg/mL,共100mL的环境,从肠道二糖酶系活性以及葡萄糖吸收的角度出EE溶液。使用AB8大孔树脂装入20cm×40cm玻璃色谱发,研究了杜仲叶20%乙醇解吸物降血糖机制。本实验柱,柱床体积60mL进行分离纯化。首先,吸附过程中调首先对杜仲叶乙醇提取物( ethanol extract of Eucommia节流速为10mL/min,直到提取液完全进入树脂层;充分uLmoides leaves,EE)进行分离纯化,并以酶-抑制剂吸附后依次使用200mL的0、20%、40%、60%、80%乙为模型通过酶促反应动力学研究,判断杜仲叶20%乙醇醇溶液以2.0ml/min流速进行洗脱,收集解吸液,分别解吸物对a-葡萄糖苷酶的抑制类型及亲和度;然后借助为EEA、EEB、EEC、EED、EEE,浓缩后冷冻干燥,备Caco-2细胞模型,研究了杜仲叶20%乙醇解吸物的降糖作用,并初步探讨其作用机制;最后利用气相色谱质谱联用。具体的提取分离流程如图所示。用仪( gas chromatograph- mass spectrometer,GCMS)对杜仲叶烘千粉碎,过20目杜仲叶20%乙醇解吸物主要降糖成分进行分析。本实验40%乙醇溶液,料液比1:60(m),浸泡2.5h可以从糖的消化转运途径阐明杜仲叶降血糖保健功效[超声波,1的原理,为进一步生产杜仲叶降血糖保健品提供理论旋转蒸发浓缩依据。[空冷冻1材料与方法AB8大孔树脂分离纯化,得到杜仲叶乙醇提取物0%乙醇解吸□20%乙醇解吸40%乙醇解吸60%乙醇解吸乙醇解吸(EEA)(EEB)I(EEC)L(EED)L(EEE)11材料与试剂杜仲叶采集自陕西汉中略阳县。酶抑制剂模型筛选高抑制率的杜仲叶乙醇提取物EEB大孔树脂(AB-8)天津市南开大学化工借助C2细胞,研究EB抑制葡萄糖苷酶活性厂;α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷EEB的GCMS成分分析(4 nitrophenyl-a-D- glucopyranoside,PNPG)、噻唑图1杜仲叶活性成分提取分离流程R(3-(4, 5-dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyl-2-H-Fig 1 Extraction and separation of bioactive components fromtetrazolium bromide,MTT)美国 Sigma公司;Caco2Eucommia ulmoides leaves※营养卫生且品科兽2014,Wl.35,No.171991.32杜仲叶乙醇提取物对酶抑制剂模型的a葡萄糖苷200μLEEB,使EEB终质量浓度为005、0.10、0.20酶的抑制作用0.50、1.00mg/mL;置37℃反应40min后移入冰浴,迅速在9孔酶标板上,每个样品做3个平行实验,在每个吸出反应液50,分别加入200L的葡萄糖试剂盒中孔中先后加入120μ05moM的磷酸缓冲液(pH67),37℃反应30min,在490m波长处测定吸光度A并记录,20μL一定质量浓度的杜仲叶乙醇提取物,50μa葡萄糖计算抑制率及IC苷酶溶液(25mgmL)和50μPNPG(3 mmolL),混匀酶活力单位定义:每分钟分解10mo底物为一个后37℃反应1h,然后加入50μ碳酸钠溶液(067mo)酶活力单位。按公式(3)计算二糖酶活力。终止反应,最后在405nm波长处用酶标仪测定吸光度吗。CN按公式(1)计算酶活性抑制率。二糖酶活力(μmo(L·min))=(3)酶活性抑制率%=4-42+4式中:c为反应所释放的葡萄糖浓度/(pmol):NA(1)为样品稀释倍数;t为反应时间/min;B为1个单位的二糖式中:A1为空白组吸光度,20的去离子水代替分解后葡萄糖释放量(即麦芽糖B为2)提取液;A2为实验组吸光度;A3为背景组吸光度,只1.36EEB对Caco2细胞模型葡萄糖吸收的影响加入提取物,以100μL磷酸缓冲液代替a-葡萄糖苷酶实验在24孔板的单层细胞上进行。实验前弃去培养及PNPG。液,细胞用PBS洗3次,除去细胞表面附着物。加入含133EEB对a-葡萄糖苷酶抑制的动力学实验EFB的PBS04mL,置37℃孵育10min后加入0.55 mmolL选定质量浓度为10、20mg/mL的EEB,分别加入浓的葡萄糖溶液1.6mL,使EEB终质量浓度分别为0.05度()为1、3、6、9、12 mmol/L的PNPG,按照1.320.10、0.20、0.50、100mgmL:空白组以04 mL PBS代节方法作出不同浓度的PNPG吸光度A随时间变化图,并替含EEB的溶液。37℃培养箱中培养40min,迅速吸出以直线部分求速率V,同时测定不加抑制剂时不同浓度溶液,用冰冷(4℃)PBS洗细胞3次,收集细胞,反复PNPG的反应速率。按 Lineweaver-Burk作图,以IS冻融破碎,分别测定细胞中葡萄糖及蛋白质含量2。细为横坐标,1为纵坐标,分别绘制不同浓度EEB的抑制胞葡萄糖含量测定采用氧化酶葡萄糖试剂盒法;细胞蛋作用动力学曲线,求出米氏常数K并根据竞争性抑制动白质含量测定采用考马斯亮蓝法。力学方程(2),确定抑制常数K值13.7EEB成分分析1/Km=l/(Km(1+[K)(2)取干燥样品EEB置于安培瓶中,无水分残留,否式中:K为加入抑制剂后的米氏常数;四为B浓度则会影响衍生化的效果。以1:1(VV)的比例加入衍134EEB的细胞毒性实验生化试剂,含0.1%TMCS的 BSTFA,将安培瓶口封采用MTT法,选择EE对caco2细胞的安全质量浓好,超声波处理lh,放入100℃的烘箱中加热,取出度。将细胞悬液稀释为3×10个/mL,混匀后每孔100山后冷却至室温接种于96孔板上,37℃、5%CO2环境中孵育24h,弃气相色谱检测条件:进样量为1u,分流进样,分上清液,贴壁细胞用于实验,每孔加入含EEB的完全培养基(对照孔只加完全培养基)100μL,培养48h后检流比30:1;Rx5毛细管柱(30m×032mm,0.5μm);测细胞增殖情况。加MTT(5mg/mL)每孔20μ,胃程序升温柱温设置:柱初温50℃,升温速率6℃/min,升至250℃,继续升温,速率15℃/min,升至280℃,取( dimethyl sulfoxide,DMso)每孔200,避光振荡保持时间不少于10mim,按口温度250℃,进样口温15min,于酶标仪570m波长处测定吸光度度270℃。质谱条件:EI离子源温度220℃,电离电压1.3.5EEB对Caco-2细胞模型a-葡萄糖苷酶活性的70eV,倍增器电压350V,扫描范围33~500amu,扫描抑制速率05s/次。实验分为空白组、阴性对照组、阳性对照组、实验14数据处理组,Caco-2细胞接种于24孔板上(4×104个/mL),培实验最少重复3次取平均值,表示为士s,所有数养至12d。实验前弃去培养液,细胞用PBS洗3次,除去据用SPSS20.0软件处理,用 Duncan's法进行方差分析,细胞表面附着物。空白组每孔加入1 mL PBS;阴性对照组P<005为差异显著。每孔加入800μ28mmo麦芽糖溶液和200μPBS;阳性对照组每孔加入800山28mmo麦芽糖溶液和200μ2结果与分析阿卡波糖溶液,使阿卡波糖终质量浓度为0.20mg/mL实验组每孔加入800μL28mmol/L麦芽糖溶液和21杜仲叶乙醇提取物对a-葡萄糖苷酶的抑制作用2002014,Vo.35,No.17品利字※营养卫生由图4可知,在0、0.05、0.10、0.20、0.50、100mg/mL条件下吸光度A50m分别为0.818±0.046、0.849±0.015、0.849±0.033、0.783±0.0530.767±0.118、0.74±0.037。实验组与空白组无显著差异(P>0.05)。这说明实验质量浓度下,EEB对Caco2细胞无明显毒性。EEA EEB EEC EED EEE组别24Caco2细胞中EEB的降血糖机制小写字母不同表示差异显著(P<0.05)2.4.1EEB对Caco-2细胞模型的a-葡萄糖苷酶抑制作用图2大孔树脂分离纯化后各成分对a葡萄糖苷酶抑制率Fig2 Anti-a-glucosidase activity of the fractions separated from the40% ethanol extract of Eucommia ulmoides leaves by macroporousresin adsorptionR16经大孔树脂动态纯化后的杜仲叶乙醇提取物对a-葡120萄糖苷酶有一定的抑制作用,由图2可知,EEB对a-葡萄糖苷酶的抑制率最高,为(43.08±0.55)%;其次是0.60.81.0EEB质量浓度/(mg/mLEEC,(26.74±0.32)%,比EEA高114%;而EED抑制图5EFB对a葡萄糖苷酶酶活性的抑制作用率只有(13.87±0.20)%,是5个组分中最低的。ig.5 Anti-a-glucosidase activity of EEB in Caco-2 cells22EEB对a葡萄糖苷酶抑制动力学如图5所示,EEB在以麦芽糖为底物时对Caco-2细胞中a-葡萄糖苷酶活性有一定的抑制作用。当EEB质23409x+47513量浓度为0.05、0.10、0.20、0.50、1.00mg/mL时,抑200R2=09814无抑制剂制率分别为(19.50±193)%、(32.07±1.08)%、m 10 mg/mL EEB(4421±334)%、(49.11±3.78)%、(51.75±215)%。▲20mg/ mL EEB04=02000204060.81012其ICs值为0.57mg/mL。随着EE质量浓度的升高,a葡I/[S/(L/mmol)萄糖苷酶活性逐渐降低,说明其抑制α-葡萄糖苷酶活性图3EEB的 Lineweaver-Burk的双倒数曲线具有质量浓度依赖性。Fig-3 Lineweaver-Burk curve of EEB2.42EEB对Caco-2细胞模型葡萄糖吸收的影响由图3可知,最大反应速率(Vmx)随着抑制剂质量浓度的增大保持不变,米氏常数(Km)增大,说明了EEB对a-葡萄糖苷酶底物在该酶上的络合位点相同,号20互相竞争,属竞争性抑制剂。根据竞争性抑制动力学方程1/K=/kn(1+[/K;)},从图3中求得EEB质量浓度为10、20mg/mL时Kn,再根据a-葡萄糖苷酶的K和Vmx,可求出EEB质量浓度为10、20mg/mL时K的均值0.6EEB质量浓度/(mgmL)为32.90mg/mL。图6EEB对Caco-2细胞的葡萄糖吸收抑制作用23EEB的细胞毒性实验g6 Anti-absorption of glucose of EEB in Caco-2 cells如图6所示,空白组中葡萄糖吸收量为3018μ moVing;添加EEB的实验组中,Caco-2细胞对葡萄糖吸收量出现0.4定程度的降低。随着EEB质量浓度的上升,抑制率逐渐上升。这说明EEB对Caco-2细胞模型葡萄糖吸收有一定的抑制作用,1mgm时抑制率为(26.25±0.86)%0.501.00EEB质量浓度25EEB硅烷化衍生物GCMS分析不同质量浓度EEB对Caco2细胞生长的影响EEB的GCMS总离子流图如图7所示。其中一部分化Effect of EEB on the合物由于含量少或者无法衍生化为挥发性物质,故无法※营养卫生品科兽2014,Vol.35,No.17201确定其化学结构,也有一部分为杂峰,予以扣除后通过机酸种类最多,包含饱和脂肪酸,不饱和脂肪酸以及芳标准质谱库检索和人工解吸相结合,分析EEB中主要降香族脂肪酸。饱和脂肪酸中主要含有草酸(0.95%)血糖成分,结果见表1。乳酸(0.57%)等;不饱和脂肪酸主要含有2-酮-D-葡萄糖酸(2.63%)、10,12-二十二碳二炔二酸(142%)(表中未列出)等;芳香族脂肪酸中2,6-二羟基苯甲酸含量较高,为211%。酚类化合物总相对含量为4.36%分别为百里酚(0.67%),邻羟基苯乙醇(0.46%),3,4-二羟基-苯丙烯酸(1.9%),儿茶素(0.88%)4-羟基-3-甲氧基苯乙二醇(0.45%)。EEB还检测到左12515015210252302530253544254604595旋葡聚糖(0.62%)、阿拉伯呋喃糖(1.46%)、呋喃半时间/min乳糖(1.81%)、吡喃葡萄糖(3.09%)、吡喃甘露糖图7EEB的总离子流图Fig 7 TIC profileof EEB(2.37%)、D岩藻糖(0.65%)等单糖类化合物。就氨基酸而言,5氧代脯氨酸相对含量为054%;4羟基脯氨酸相对含量为1.25%。醇类物质而言,3,4-双脱氧己糖醇表1EEB中抑制a葡萄糖苷酶成分的相对含量able 1 Relative contents of aase inhibitors in EEB相对含量为054%;桃金娘烯醇为0.54%。此外,EEB中序号保留时间mnEEB成分相对含量%还含有07%甲酚甘油醚;0.7%苯胺羰酸;0.45%VB等草酸物质。乳酸15219665氧代腩氨酸1623.628百里酚3讨论1723.724邻羟基苯乙醇1824271D甘露糖酸14内酯小肠绒毛壁上皮的二糖酶系丰富,可引起餐后血糖192537826二羟基苯甲酸212627534双脱氧己糖醇升高,其中最重要的是a-葡萄糖苷酶2。本实验发现2226529左旋葡聚糖杜仲叶20%乙醇解吸物(EEB)有很强的体外抗α-葡萄糖2326697苯基乙醇酸苷酶活性,并且EEB与a-葡萄糖苷酶有较高的亲和性(K2427558桃金娘烯醇27697阿拉伯呋喇糖值为3290mg/mL)。进一步的实验结果表明,EEB对于262777D葡萄糖酸-1,4内酯Caco-2细胞中a-葡萄糖苷酶活性也具有较强抑制作用,并2827996甲酚甘油醛且可以抑制Caco-2细胞对葡萄糖的吸收。GCMS分析表30285512酮D葡萄糖酸2.63明,杜仲叶EEB含有重要的抗a-葡萄糖苷酶成分,包括百3228.791苯胺羰酸里酚、儿茶素、2,6-二羟基苯甲酸、3,4-二羟基-苯丙烯3329122呋喃半乳糖3629891吡喃葡萄糖309酸和DL-异柠檬酸内酯等成分,含量最高可达1379%383135111甲氧基37,11三甲基24十二碳二烯酸甲酯正常人进食后,食物中的碳水化合物如淀粉先在3931640吡喃甘露糖a淀粉酶作用下生成麦芽糖、麦芽三糖等,随后经a-葡42349704二羟基苯丙烯酸4337.0554羟基脯氨酸萄糖苷酶水解作用生成葡萄糖等,经肠壁细胞吸收而被4648.147茶素机体利用。因此抑制α-葡萄糖苷酶活性,阻碍二糖进4748.533D岩藻糖步分解对于延缓餐后血糖值升高有着重要作用。现在研48.72850492284羟基3甲氧基苯乙二醇究多采用PNPG为底物的酶-抑制剂模型,筛选强活性的5351.3084氨基5咪唑甲酰胺α-葡萄糖苷酶抑制剂。但是这种模型无法直接评价筛选51.552L异柠檬酸内酯得到的降糖物质在体内的药效作用,存在假阳性率高、体内外活性差异较大、临床效果不理想等弊端。因此由表1可知,EEB主要以内酯类、有机酸、酚类、本实验在采用PNPG为底物的酶-抑制剂模型基础上,借单糖类、醇类、氨基酸为主。除此之外,还有核苷、醚助Caco-2细胞模拟人体小肠壁环境,克服了体内外活性类、胺类、烯烃类化合物。差异大等缺点,并在此基础上研究了EEB降血糖机制EEB成分中含有的内酯类化合物相对含量最高,为Caco-2细胞来源于人结肠腺癌细胞,体外培养达到融合16.75%。这其中DL-异柠檬酸内酯的相对含量最高,达后,可自然分化为与成熟小肠细胞具备类似形态和生化到了1379%,其次为D甘露糖酸-1,4-内酯(073%),特性的细胞。目前Caco2细胞主要用于药物吸收转运机D葡萄糖酸-14-内酯(2.23%)。EEB成分中含有的有制研究,可表现出与人小肠上皮细胞相似的与糖消化2022014,vo.35,No.17自品科字※营养卫生吸收有关的酶以及蛋白质。故可借助Caco-2细胞所表山奈酚a-3OB-葡萄糖和杜仲醇。本实验分析得到了儿达的α-葡萄糖苷酶构建模型来研究EEB对α-葡萄糖苷酶的荼素,含量为0.88%。由于提取分离杜仲叶方法不同,作用。并未检测到槲皮素、山奈酚a-3-O-B-葡萄糖和杜仲醇。首先在酶-抑制剂模型中,EEB抑制率最高,为但是,EEB中的其他成分可能具备抑制a-葡萄糖苷酶的(43.08±0.55)%。其次酶促反应动力学研究发现活性。桂花中的脂肪酸具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制活EEB对a-葡萄糖苷酶抑制类型为竞争性抑制且K值仅为性国。EEB成分中含有有机酸的种类最多,包含10种饱32.90mg/mL,这说明EEB与α-葡萄糖苷酶有很高的亲和和脂肪酸,6种不饱和脂肪酸以及3种芳香族脂肪酸。性。之后进一步利用Caco-2细胞模型发现,EEB以麦芽其中不饱和脂肪酸含量最高,达6.86%。杜仲多糖对四糖为底物时对细胞内a-葡萄糖苷酶有较强抑制率。EEB氧嘧啶致糖尿病小鼠有一定的降血糖作用。苦瓜多糖抑制a-葡萄糖苷酶活性随着EEB质量浓度升高而升高,和芦荟多糖都有降血糖的作用,而苦瓜多糖主要由阿拉ICs值为0.57mg/mL。对比常用降血糖药物-阿卡波糖在伯糖、半乳糖和鼠李糖等构成;芦荟多糖以甘露糖、阿020mg/mL时对a-葡萄糖苷酶活性抑制率为6792%,同拉伯糖等构成。本实验发现EEB含有的单糖类化合物等质量浓度的杜仲叶乙醇提取物抑制率达到了5757%。相对含量为13.25%,其中吡喃甘露糖含量相对较高葡萄糖吸收过程中主要涉及钠葡萄糖共转运载体1为2.37%;阿拉伯呋喃糖含量为1.46%;呋喃半乳糖为( sodium/ glucose cotransporter-1,SGLT-1)、葡萄1.81%。茶多酚对a-葡萄糖苷酶有较强的抑制活性且延缓糖协助扩散转运载体2( glucose transporter2,GLUT-2)小肠对糖的消化吸收起到降糖作用。EEB中儿茶素含两种跨膜转运载体蛋白(28。其中位于小肠细胞黏量为088%。除此,EEB中还检测到百里酚、3,4二羟基膜表面上的SGLT-1起主导作用,其在细胞基底膜苯丙烯酸、4-羟基-3-甲氧基苯乙二醇等酚类物质。海带NaK-ATP酶作用下逆№浓度差,消耗能量,主动转运葡萄中提取得到的D甘露醇与丙酮合成的二异亚丙基甘露醇糖。因此,肠道葡萄糖的跨膜吸收主要涉及SGLT1、可抑制a-葡萄糖苷酶活性。EEB中可分离得到5种醇类GLUT2和Na-KATP酶共3种蛋白。Caco-2细胞模型成分(327%)。EEB中内酯类化合物的相对含量最高,中,EEB除可抑制α-葡萄糖苷酶活性外还可抑制葡萄糖为1675%,其中DL-异柠檬酸内酯的相对含量最高,达到摄取吸收,1.00mg/mL时抑制率26.25%。针对EEB抑1379%。此外,EEB中还检测出2种氨基酸(17%)制℃aco-2细胞中葡萄糖吸收的具体机制尚不清楚。但研分别为5-氧代脯氨酸和4羟基脯氨酸。L-羟基脯氨酸能使究表明,茶叶提取物可通过竟争性抑制Caco-2细胞膜上正常小鼠进食量明显增加时而不增加体质量增长速率,减SGLT-I、GLUT-2、GLUT-5等葡萄糖转运蛋白的活性来少营养性肥胖模型大鼠的体质量馴。根据以上成分结构鉴抑制细胞对于葡萄糖的吸收。夏枯草提取物可能通过定,本实验发现EEB含有儿茶素、百里酚、吡喃甘露糖、抑制SCLT-1、GLUT-2及Na'-K‘-ATP酶在mRNA水平上的2,6二羟基-苯甲酸,3,4二羟基-苯丙烯酸和DL-异柠檬酸表达,抑制转运蛋白生成量,从而降低葡萄糖吸收量。内酯等成分,含量最高可达13.79%。推测这些成分可以抑因此,EEB可能通过抑制葡萄糖转运蛋白的活性或者抑制a-葡萄糖苷酶活性,为测定其在杜仲叶中的含量以及进制葡萄糖转运蛋白在mRNA水平上的表达,从而实现对步研究它们对a葡萄糖苷酶的抑制作用奠定了基础。葡萄糖吸收的抑制。在本实验基础上,可通过继续实验研究在Caco-24结论细胞模型上EEB对于蔗糖酶、乳糖酶、海藻糖等其他二糖酶的抑制效果,研究其对葡萄糖转运蛋白的影本实验发现,杜仲叶乙醇提取物降血糖效果主要是响,以便于进一步研究EEB的降血糖机制。综上可通过抑制α-葡萄糖苷酶活力,减少葡萄糖吸收,降低餐得,EEB可通过抑制a-葡萄糖苷酶活性及葡萄糖吸收后高血糖实现的。本实验从糖的消化转运途径阐明了杜起到降血糖的效果。仲叶降血糖保健功效的原理,为杜仲叶治疗糖尿病的开药用植物中,具备抗a-葡萄糖苷酶活性的有效成分发利用打下了理论基础。主要由多酚、黄酮及黄酮苷、生物碱、三萜及其苷类、肽类、酯类、酸类等组成。GCMS分析EEB主要成参考文献分含有酸类、单糖类、多酚、酯类、氨基酸等物质。有]王华.糖尿病药物治疗的研究进展U]临床合理用药杂志,2010研究发现,利用高效液相色谱法分离杜仲茶甲醇提取物3(3):123-124.可得到5种α-葡萄糖苷酶抑制剂分别为:槲皮素、儿茶[2]季芳,肖国春,董莉,等.药用植物来源的a葡萄糖苷酶抑制剂研究进展U中国中药杂志,2010,35(12):16331640素a(78-bc)-44(34二羟基)a(3HD吡喃糖、儿B李玉萍,白冰,叶军,等,a葡萄糖苷酶抑制剂的制备和活性研究进茶素-a(7,8-b.c)4B-(3,4二羟基)-a(3H)葡萄糖展门食品科学,2008,299):617-62※营养卫生良品利享2014,W.35,No.172034】] 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