海头红乙醇提取物的化学成分分析

农学学报2014,4(1):90Journal of Agriculturewww.caa].org海头红乙醇提取物的化学成分分析林勇',欧阳桐娇2,张迪',王宏雨',毛方华(福建省农业科学院食用菌研究所,福州350003:福建省农业科学院生物技术究所,福州350003)摘要:研究红藻海头红( Plocamium telfairiae harⅳ)的化学成分,分析其抗菌活性来源。通过硅胶柱色谱、 Sephadex Lh-20凝胶柱色谱和薄层色谱对海头红乙醇提取物的抗菌成分进行活性追踪分离,并通过质谱和波普数据分析鉴定化合物的结构。在分离过程中得到4种化合物,通过GCMS、HM和"C-NMR对化合物进行分析鉴定,经鉴定4种化合物分别为十六烷酸、十八烷酸、对羟基苯甲酸、邻苯二甲酸二辛脂,对羟基苯甲酸为海头红乙醇提取物中的一种抗菌化合物。关键词:海头红;乙醇提取物;化学成分中图分类号R2842文献标志码:A论文编号:2013-0599Studies on the Chemical Compounds of the Ethanol Extract of Plocamium telfairiae Harv.Lin yong, Ouyang Tongjia, Zhang Di, Wang Hongy(institute of Edible Fungi, Fujian Academy of Agricultural Science, Fuzhou 350003, Fujian ChinaBiotechnology Institute, Fujian Academy of Agricultural Science, Fuzhou 350003, Fujian China)Abstract: To study the chemical constituents and antimicrobial compounds of Plocamium telfairiae Harv, thesilica gel column, SephadexLH-20 column and thin layer chromatographic techniques were applied to separateand purify the compounds. structures of compounds were confirmed by the data of mass spectrum and spectral.Four compounds were isolated from the ethanol extract of Plocamium telfainiae Harv. Then these compoundswere identified by GC-MS, H-NMR and C-NMR spectral analysis. Four compounds were identified asn-hexadecanoic acid, octadecanoic acid, 4-hydroxybenzoic acid, dioctyl phthalate. The 4-hydroxybenzoic acidwas an antimicrobial compounds from ethanol extract of Plocamium telfainiae HarvKey words: Plocamium telfairiae Harv. Ethanol Extract; Chemical Compounds0引言头红抗肿瘤成分进行了研究,报道了胆甾醇、3-B-乙海头红( Plocamium telfairiae hary)为红藻门杉藻酰氧基胆甾-5-烯-7-酮、胆甾醇-十八烷酸酯等6个化合目海头红科海头红属海藻,生长在低潮带岩滩上,主要物。课题组前期对海头红提取物的抗菌活性进行了分布于太平洋西海岸。国内外对海头红属的多种海藻研究发现海头红的乙醇提取物对食用菌生产中的竞的化学成分进行了研究,结果表明海头红属的许多海争性杂菌具有较好的抑制活性,但是对其具体抗菌藻含有多种卤代单萜以。但关于海头红属中的海头红活性的来源还不清楚,而且有关海头红中抗菌化学成种的化学成分研究的报道较少见,仅国内少数学者对分的研究目前还处于空白的状态。因此,笔者尝试对其进行了研究。苑辉卿等对青岛沿海的海头红的成分海头红乙醇提取物中的抗菌成分进行进一步的追踪分进行了分析,鉴定了三十四烷、四十三烷、β谷甾醇、对离,通过分离出其中的主要抗菌成分,继而明确其抗菌羟基苯甲醛、尿嘧啶等10个化合物艹,张翼等人对海活性的来源,从而为相关抑菌机理的研究和应用提供基金项目:福建省自然科学基金计划资助项日“海头红提取物对食用菌病害菌抑制作用的研究”(2010J01100第一作者简介:林勇,男,1971年出生,福建平潭人,副研究员,硕士,主要从事食用菌天然产物研究。通信地址:350003福建省福州市五四路247号福建省农科院创新大楼1215室,rel:0591-87869480, E-mail: Foresty@163com通讯作者:欧阳桐娇,女,1963年出生,福建福州人,副研究员,本科,主要从事生物技术和天然产物研究。通信地址:350003福建省福州市五四路247号福建省农科院创新大楼1215室,Tel:059157869480,Emil: foresty@126om收稿日期:20130809,修回日期:2013-10-09Www。 caa.orgJ◇A农学学报参考。PeE1~PeEl共11个级分;PeE2~PeE6部分继续通过硅1材料与方法胶层析以氯仿-甲醇[(15~3):门进行梯度洗脱,得到11仪器与材料PeEL~PeEC32共32个级份,PeEC5~PeEC7得到有抗11.1提取材料海头红采集于福建石狮市永宁镇海岸菌活性的油状部分D,PeEC9 PeSCI2级分上岩滩,回后用清水洗去藻体表面杂质再次用蒸馏水 Sephadex lh-20层析柱进一步纯化,以氯仿:甲醇=1:1洗净,然后放置于室内阴干备用。洗脱得到12个流动分,其中级份3-4通过丙酮反复重112试剂 Sephadex LH-20( Pharmacia公司);柱层析结晶得到针状结晶化合物3约15mg用200-300目硅胶(国药试剂集团有限公司);GF254薄1.23海头红化学成分的仪器分析GCMS仪系安捷层层析硅胶板(青岛海洋化工厂);其他常规药品、试剂伦68905973n色质联用仪,色谱柱DB-5ms毛细管为国产分析纯。柱。气相色谱条件:进样口温度:250℃;分流比501;1.3仪器安捷伦68905973n色谱-质谱联用仪(英国升温程序:100℃(5mn)→5℃/mn→280℃(5min)质谱安捷伦公司); AVANCEⅢ500核磁共振仪(瑞士条件:离子源E:电离电压70eV:;扫描范围:50Bruker)。500amu。核磁共振波普分析采用 Bruker的 AVANCE121海头红提取物的制备将已经阴干的海头红,于表示,以TMS作为内标,偶合常数(用H表PD1.2试验方法ⅢI500型核磁共振仪频率500MHz,位移值(δ用ppm45℃下烘干24h后用高速万能粉碎机粉碎成粉末。取2分析鉴定海头红藻粉2kg,用3倍体积量的95%乙醇浸提22.化合物次,每次浸提3天。将提取液过滤、旋转蒸发仪减压浓白色细鳞片状粉末,HNMR(CDCl,500MHz)缩后析出大量无机盐,过滤取滤液继续浓缩得到黑褐088(3H,t-6.5Hz),1,2(24H,m),1.502H,m),2.28色浸膏60.25g,占藻粉总重的24%。(2H,t,J70Hz);"C-NMR(CDCl,125MHz)6180.34,12.2海头红提取物的分离将海头红提取物浸膏以34.18,31:82,29,57,29.39,29.34,29.26,29:08,27.35,70%甲醇溶解分散,依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃24.70,2270,14.05;GCMS:T-996mim,Area=100%,取,石油醚萃取完后先用旋转蒸发仪蒸掉甲醇再用氯Qua}98(n- hexadecanoic acid); EI-MS m/z.256M仿和乙酸乙酯进行萃取,每种溶剂萃取3次。将萃取241,239,227。通过质谱数据库检索以及与相关文献收集的各部分溶剂用旋转蒸发仪蒸干获得各萃取部的核磁数据对比,该化合物数据与十六烷酸信息一分,分别得到石油醚萃取部分25.88.7%)氯仿萃取致,故确定化合物1为十六烷酸部分175g(0.7%)乙酸乙酯萃取部分9.1g(0.36%)。22化合物2石油醚萃取部分通过硅胶柱层析,以石油醚-乙酸白色粉末, H-NMR(CDCI2,500MHz)6:0.88(3H,乙酯[(20-1)梯度洗脱,最后以乙酸乙酯清柱,获得t}6.5H),1.26(28H,m,1.58(H,m),2.30(2H,t,PE1PEl1共11个级分,PE2级份以正己烷二氯甲烷:7.5H);CNMR(CDCl,125MHz)6:180.21,34.08,甲醇=3:3:1为洗脱剂在 Sephadex-20凝胶柱上进3190,2975,29662964、29.59,2945.29.38.2926步纯化得到白色鳞状化合物1约200mg24.70,22.70,14.08;GC-MS:Tr=1282min,Area98%,氯仿萃取部分部分进行减压硅胶柱层析,200Qma99( Octadecanoic acid);EMsm:284M;,300目硅胶,干法上样,氯仿萃取相以石油醚丙酮[(20:1)2356,241,213,199。通过质谱数据库检索以及于相关(1:10)进行梯度洗脱,以丙酮清柱,获得PeAl-PeAl3文献的核磁数据对比,该化合物数据与十八烷酸信共13个级份。PeAl-PeA2级分以正己烷:二氯甲烷:甲息一致,故确定化合物2为十八烷酸醇=3:3:1为洗脱剂在 Sephadex20层析柱上进一步23化合物3纯化得到白色粉末状化合物2约10mg:PeA5PeA7级白色针状结晶,HNMR( CD, COCD2,500MHz)分继续通过硅减压胶柱层析以氯仿-甲醇(15~5):1]梯8:6.93(2H,d,卢8.5Hz,793(2H,d,8.5Hz);度洗脱,获得 PeALl-PeAL24共24个流份,通过 C-NMR(CD, COCD,125MH)6:15.73,122.49,GF254硅胶板薄层层析检测合并相同部分,132.51,162.38,167.16;GCMS:Tr4lmin,ArcaPeAL3~PeAL4级分得到油状化合物4约80mg95%, QuaA59(Benzoic acid, 4-methoxy-); EI-MS m/z乙酸乙酯萃取部分通过硅胶柱层析,以石油醚-乙138M,121,93。将核磁数据和质谱信息与相关文献酸乙酯(5:1-1:5进行梯度洗脱,以乙酸乙酯清柱,获得的对比,该化合物数据与对苯羟基苯甲酸的数据基本林勇等:海头红乙醇提取物的化学成分分析致,故确定化合物3为对羟基苯甲酸中活性成分的含量一般比较低,而传统检测方法大多(p-hydroxybenzoic acid)需消耗较多样品,这就导致在追踪分离过程中常常发24化合物4生未分到目标化合物样品就已消耗殆尽的情况。笔者淡黄色油状液体,HNMR(CDCl,500MHz)6:在研究过程中也犯了同样的错误,导致许多活性级分093(12H,m),1,42(16H,m),1.6l(2H,m),4.12(4H,d,的丢失,仅少数含量较高的成分能完成纯化鉴定。因110H,52Hz),7.52(2H,dd,J6.0Hz,30Hz),7.9而,为了提高活性成分追踪分离的效率和全面性,有必(2H,d,6.0Hz,3.0Hz);"CNMR(CDCl2,125MHz)要改进活性跟踪的检测方法,.用诸如TLC生物自显6:16718,132.58,1309,12864,680,3867,30.16,影技术酶标仪浊度法等新型的微量检测手段,对2862,2404,22.96,1442,10.65;GCMS:Tr=192min,海头红乙醇提取物再进行系统性的分离、分析Area=93%, QuaH90(1, 2-Benzenedicarboxylic acid, Bis试验过程中还从海头红的乙醇提取物中分离到了(2 ethylhexyl) ester,EMSm么279,251,167,149。邻苯二甲酸二辛酯,邻苯二甲酸二辛酯目前多用作塑通过质谱数据库检索以及于相关文献的核磁数据对料增塑剂,在各种医疗用品中广泛使用。因而,其有可比12,该化合物数据与邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯能源自试验操作过程中的容器污染。张翼等对海头信息一致,故确定化合物为邻苯二甲酸二(2-乙基己红的脂溶性成分的研究中也发现了邻苯二甲酸二辛脂基)酯,又名邻苯二甲酸二辛脂。和其他邻苯二甲酸脂类,它们的含量在检测样品中达3讨论到了5042%,含量之高远超出外源污染合理值,因而笔者首次对海头红乙醇提取物中的抗菌成分进推测邻苯二甲酸脂类亦有可能是海头红本身的次生代行了追踪分离,并对追踪分离过程中获得的几种化合谢产物,有待进一步研究确认。物并进行了分析鉴定。在研究过程中,从乙酸乙酯萃取相中分离到了具有抗菌活性的油状级分D和对羟基参考文献苯甲酸。通过对D级分进行GCMS分析发现其中的1] Diaz-Marrero A r, Rovirosa j, Arias j,etal. Plocamenols A-C抗菌成分为对羟基苯甲醛,但由于D级分样品数量有novel linear polyhalohydroxylated monoterpenes from Plocamium限,笔者未对D级分进行进一步的分离,苑辉卿等在cartilagineum[]. Joumal of Natural Products, 2002, 65: 585-588对海头红化学成分研究过程中分离也到了对羟基苯甲2] Jongaramruong, Blackman AJ. Polyhalogenated monoterpenesfrom a Tasmanian collection of the red seaweed plocamium醛。另外一个抑菌成分对羟基苯甲酸与对羟基苯甲醛cartilagineumJ] Joumal of Natural Products, 2000,63: 272-275是类似物,其可由对羟基苯甲醛氧化产生。由此可见,[3] Rezanka Tomas, Dembitsky Valery M. Polyhalogenated海头红藻体内这些酚类物质的含量是较高的,其有可homosesquiterpenic fatty acids from Plocamium cartilagineumJ]能是海头红乙醇提取物抗菌活性的主要来源。Phytochemistry, 2001, 57: 607-611对羟基苯甲酸的脂类衍生物又称为尼泊金脂,是苑辉时岩鹏曲显俊等红藻海头红药效学及化学成分的研究1[中国海洋药物2000195):7-l类低毒、高效、用量少抑菌谱和pH适用范围广的优1苑辉卿阎明涛书兴光等红藻海头红化学成分的研究中国良抗菌防腐剂,其中的对羟基苯甲酸甲酯及其钠盐药学杂志2001,36(12)806808和对羟基苯甲酸乙酯及其钠盐在GB2760中列为可在(6张翼海藻抑制乙酰胆碱酯酶活性及红藻海头红化学成分的研究直接摄入食品中应用的防腐剂吗。目前的研究表明[D]青岛:中国科学院海洋研究所2004对羟基苯甲酸脂类的抑菌力和抑菌谱特性可以由其碳7]欧阳桐娇,郑怡刘艳如等海头红提取物抑制食用菌竞争性杂菌链长度进行调整,同时有些对羟基苯甲酸脂类例如的研究[江西农业学报,2007,19(19):105-107[8] Anwer M Suhail, Mohtasheem M, Azhar Iqbal, et al. Chemical对羟基苯甲酸壳聚糖脂还具有较好的高温稳定性",Constituents from Melilotus officinalis]. Journal of Basic and因而其对食用菌栽培料中杂菌的防治具有一定的应用Applied Sciences, 2008, 4(2): 89-94前景。目前为止,未见有对羟基苯甲酸脂类在该领域[9]姜北赵勤实林中文等三花枪刀药化学成分研究[天然产物研应用的研究报道,有待进一步开展相关复配抗菌剂的究与开发1996,13(6:12-15研究[10] Muhammad S A, Muhammad S, Farzana A. Three p-cymene笔者在海头红乙醇提取物的抗菌成分的活性追derivativeZataria multiora] Phytochemistry, 1999, 52: 68511] Giang P M, Son P T, Matsunami K, et aL. New megastigmane踪过程中,对一些抗菌级分的抑菌活性进行了检测,相glucosides from Excoecaria cochinchinensis Lour. var.关内容另文报道。在对天然抗菌成分的分离鉴定研究cochinchinensis[]. Chem Pharm Bull, 2005, 12: 1600-1603中,分离物的活性的检测是必不可少的环节,天然产物[2J唐丽李国玉杨柄友等广枣化学成分的研究门中草药20040www.caa.orgJ农学学报93(4):541-543[16]赵希荣夏文水对羟基苯甲酸壳聚糖酯的抑菌活性研究[食品[13] Lu X H, Zhang JJ, Liang H Chemical constituents of Angelica科学2007,28(2)78-83sinensis. Joumal of Chinese Pharmaceutical Sciences,2004,13(1):[17曲建博姿红祥范培红TC生物自显影技术在药物筛选中的应用中草药2005,36(132-137[l4]杨寿清鲍福根对羟基苯甲酸酯衍生物的使用安全性和复配效果[18]宫霞乐国伟李云飞家蝇幼虫抗菌肽的抗菌谱及其与抗生素的[冷饮与速冻食品工业2003,9(4:2629协同作用[门研究微生物学报200545(4):516-520[15]中国国家标准化管理委员会GB2760-2007食品添加剂使用卫[19张翼陈昌祥,李晓明等红藻海头红脂溶性成分研究门中草药,生标准S]北京:中华人民共和国卫生部2002006,37(11)1626-1627.(上接第32页)定程度的富集,但并不显著;生长年限对灌丛根际有(5]刘增文,李雅素黄土高原柠条林地土壤肥力与养分循环门生态效磷含量的影响并无明显规律,0-5年小叶锦鸡儿灌学报,1997,16(6):27-29丛根际土的有效磷含量出现了亏缺,10~30年根际土6]苏永中赵哈林张铜会几种灌木、半灌木对沙地土壤肥力影响机的有效磷含量有明显的富集作用速效钾含量会随着(马子清山西植被北京中国科学技术出版社200856生长年限的增加出现消耗,且根际富集效应明显。[8]张强晋西北小叶锦鸡儿( Caragana microphylla)人工灌丛营养特土壤酶是存在于土壤中各酶类的总称,是土壤的征与土壤肥力状况研究[D]山西:山西大学,201:17-24组成成分之一。土壤酶活性包括已积累于土壤中的酶9]阮建云,马立锋石元值茶树根际土壤性质及氮肥的影响茶叶活性,也包括正在增殖的微生物向土壤释放的酶活科学200323(2)167-170性。它主要来源于土壤中动物、植物根系和微生物的10]李庆逵土壤理化分析M]北京科学出版社1985:6-145.[ll严永生土壤肥力研究方法M北京农业出版社998105-112细胞分泌物以及残体的分解物,与土壤中发生的生物12]李博生态学DM北京:高等教育出版柱200640化学过程关系密切。本研究表明:随着灌丛定植年[13]马斌周志字,张彩萍等超旱生灌木根际土壤磷的含量特征口草限的延长,在5~30年变化过程中,土壤过氧化氢酶和业学报2005,16()1065-10碱性磷酸酶活性在5~-10年均处于快速增长期、10-20014张学利杨树军刘亚萍,等章古台固沙林主要树种根际土壤性质年处于缓慢提高期,20~30年处于缓慢降低期。研究门中国沙漠,2004(1):72-76[5]孟亚利,王立国周治国等套作棉根际与非根际土壤酶活性和养平茬是利用小叶锦鸡儿萌蘗能力强的特性,利用分的变化门应用生态学报,2005,16(112076-2080人力定期将地面上部枝条剪去,以促进新的枝条萌[l6]张成娥陈小利林地砍伐开垦对土壤酶活性及养分的影响生生圆2。因此,综合考虑黄土高原植被的可持续性,建态学杂志1998,17(6):18-21议小叶锦鸡儿灌丛林应在30年时及时平茬利用。[17η滕晓慧曹成有富瑶不同年龄小叶锦鸡儿固沙群落土壤酶活性及微生物生物量的变化门生态环境,2007,16(3:1030-1034[18]周道玮锦鸡儿属植物分布研究J植物研究,1996,16(4):428-435.參考文献[19]刘建新不同农田土壤酶活性与土壤养分相关关系研究[门土壤通[]王孟本李洪建柴宝峰柠条的水分生理生态学特性门]植物生态报,2004,35(4):523-525学报1996,20(6):494501[20]李生荣柠条平茬更新的生物量调查及综合利用青海科技,[2]牛西午张强杨治平等柠条人工林对晋西北土壤理化性质变化2007(5):12-13的影响研究门西北植物学报200323(4):628-632.[3]牛西午柠条生物学特性研究华北农学报199813(4:122-12921]郑士光贾黎明,庞琪伟等平茬对柠条林地根系数量和分布的影响门北京林业大学学报2010,32(3)64694]王生芳何世玉柠条人工林地土壤肥力的评价门青海农林科技,98(3):29-31