乙醇含量的酶法测定

第22卷第4期分析测试学报 Vol.22 No.42003年7月 FENXI CESHI XUEBAO( Journal of Instrumental Analysis)Jul.2003乙醇含量的酶法测定柳畅先,陈勇(中南民族大学化学与生命科学学院,湖北武汉430074)摘要:利用醇脱氢酶(ADH)催化乙醇与氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD反应的原理,通过测定还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH吸光度的变化率得出其酶促反应速度,对应不同的乙醇含量而制得标准曲线,试样中乙醇含量由测定值查标准曲线求得;讨论了pH值和抑制剂对测定的影响;方法简便、快速、准确。关键词:乙醇;酶催化法醇脱氢酶中图分类号:0657.320623.41文献标识码:A文章编号:1004-4957(2003)04-0096-02乙醇含量的测定方法通常有比重瓶法、气相色谱法、伏安法等,近年来酶法在分析测定方面得到广泛应用,以酶法测定乙醇含量已有报道1-31。本研究基于醇脱氢酶催化乙醇反应:ChoH+NAD+CH CHO+NAH,通过测定还原型烟酰胺腺嘌呤核苷酸NADH吸光度的变化率得出其酶促反应速度,对应不同乙醇含量制得标准曲线,从而可测定试样中的乙醇含量。由于酶促反应的专一性,可避免试样中众多共存组分的干扰,减少繁杂的预处理过程。作者应用酶促反应速度测定法,不需要底物转变完全,可减少测定时间,节省酶的用量,并获得较高灵敏度。1实验部分1.1仪器与试剂UV-9100型分光光度计(深圳爱克分析仪器有限公司,光学读数分析天平(湘仪天平仪器厂),phs-3c型精密酸度计(上海雷磁仪器厂)WH-1型涡混合仪(上海沪西分析仪器厂)。乙醇标准溶液,醇脱氢酶(ADH),0.05mol/L氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD),0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷Tris),0.2mol/L乙二胺四乙酸二钠EDTA1.2实验方法于石英比色皿中加入3mL0.05mol/ Tris--HCl缓冲液,40μL1.7mol/L乙醇标准液,以及40L0.05mol/LNAD溶液后混匀,再加入10μLADH溶液,快速混匀后立即在所选定的波长处测定吸光度变化值△A(每隔15s测定一次吸光度值,共10次)计算酶促反应速度v:v=△A(△tEb)式中,v为酶促反应速度(mol/min);△A为吸光度变化值;V为反应液体积(mL);△t为时间变化值(min);为摩尔吸收系数(L/mmol cm);b为比色皿宽度(cm)。根据米氏方程由酶促反应速度可求出乙醇浓度:1/v=K()+1式中,K为米氏常量(mol/L)v为最大酶促反应速度(umol/min)c为乙醇浓度(mol/L)2结果与讨论2.1NADH吸收光谱本法是通过NADH吸光度的变化率测定反应速度,因此需进行NADH吸收波长实验,在无其它杂质吸收峰干扰的情况下,可选择最大吸收波长,本实验选择340mm作为测定波长。2.2pH值的影响反应溶液的pH值不但影响酶的稳定性,还影响酶活性部位中重要基团的解离状态,酶-底物复合物以及底物的解离状态,从而影响酶促反应速度。按实验方法在pH6.0~12.0范围内研究了pH值对酶促反应速度的影响。由图1可知,最佳pH值约为8.6基金项目:国家民族员会自然科学基金资助项目第4期柳畅先等:乙醇含量的酶法测定972.3共存组分的影响试验了其它醇类如甲醇、异丙醇、正丁醇、乙二醇、丙三醇与NAD的反应,发现正丁醇在ADH的作用下与NAD也发生反应,但反应速度与乙醇相比要小得多。另外,由于本研究所用的20酶法是酶促反应速度的测定,如果试样中某些共存组分为激活剂10或抑制剂,它们将可能改变反应速度而干扰测定。而金属离子0易与酶活性部位中的基团作用,因此试验了常见金属离子Mg+、5689101112 pHCa2+、Sb3+、Mn2+、Cr+、Pb2+、Cu2+、Co2+、Ni2+、Zn2+、C+、Hg2+对测定的影响,未见有激活作用。试验发现Zn2+、C+、图1pH值的影响Hg2+对酶促反应速度有抑制作用。由图2可见,随着抑制剂加入 Fig.1 Effect of pH on speed of the过加入EDTA与抑制剂络合可部分消除其影响。对2.5mmol/ enzymatic reaction量增多,对酶活性的抑制作用逐渐加强,反应速度逐渐下降。通的乙醇进行干扰试验,存在5mmol/ EDTA,相对误差在±5%80之内时,干扰组分的允许量(μmol/L)为Zn2+1700、Cd+30、60Hg2+0.3402.4标准曲线20按实验方法测出系列乙醇标准液的酶促反应速度,由于反应速度只是在底物浓度很低时,才与之成正比,当底物浓度增高020406080(Cd'*Xumol-Il)时,v-c(C2HOH)线逐渐弯曲,而根据米氏方程,1/v-1/c(Znyumol-L)( nmol-L)(C2HOH)为直线关系,因此用双倒数作图法所绘1/v-1/c图2抑制剂的影响(CHOH)曲线作为标准曲线,线性范围较宽。c(CHo)在g Effect of inhibitor on speed of0.5~20mmol/L范围内与v呈直线关系。其回归方程为: the enzymatic reaction/v=0.2113/c+0.0159,r=0.9971.+2.c+;3.n2+2.5血清乙醇含量的测定及回收试验按实验方法测定了小牛血清中的乙醇含量并进行加标回收试验,结果见表1表1试样测定及加标回收试验结果(n=5) Table 1 Determination results of ethanol in samples and recovery for added standard(=5) Original RSD Sample Added Total found Recovery/()/%/(mg) /(mg L")45.353.151.2597.810255.501.051.25104.169566.193.576.84139.495参考文献:[ ATWATER JE AKSE DEHART,tal. Enzymatic determination of ethanol using' electrocatalyzed lu minol chemiluminescence[J]. Anal Lett, 1997, 30(8) 1445-1453. [2] CASTANON M JL, ORDIERES A J M, BLANCO PT. Amperometric detection of ethanol with poly-(o-phenylenediamine)- modified enzyme electrodes[J]. Biosens Bioelectron, 1997, 12(6): 511-520. [3] PANDEY PC, UPADHYAY S, UPADHYAY B C, et al. Ethanol biosensors and electrochemic oxidation of NADH[J]. Anal Biochem,1998,260(2):195-203 Enzymatic Determination of Ethanol LIU Chang-xian, CHEN Yong (College of Chemistry and Life Science, South-central University for Nationalities, Wuhan 430074, China) Abstract: An enzymatic method was applied to determine ethanol based on the reaction of ethanol and nicoti-第22卷第4期分析测试学报 Vol.22No.42003年7月 FENXI CESHI XUEBAO( of Instrumental Analysis)Jul.2003用混合粘合剂修饰的碳糊电极测定诺氟沙星朱明芳1,宋粉云1,毋福海2,曾勇胜3,常青,黄庆华,廖月镜(1.广东药学院药学系,广东广州5102242.广东药学院预防医学系,广东广州5102243.广东省阳西县卫生防疫站检验科,广东阳西529500)摘要:在pH10.50的磷酸盐缓冲溶液中,当含有0.mmol/的NCl,8mg/L的S(十二烷基磺酸钠)时,诺氟沙星在由69.1%(w)的石墨粉、24.5%()的液体石蜡和6.4%(w)的甘油组成的混合粘合剂碳糊电极上产生一灵敏的阴极溶出还原峰,峰电位为1.61V;峰电流与诺氟沙星浓度在8.0×10--4.0×10-7mol/l范围内呈良好的线性关系,相关系数为r=0.9949,检出限为3.0×10-mol/L;该法用于测定诺氟沙星胶囊含量,结果令人满意。关键词:诺氟沙星;碳糊电极;伏安法中图分类号:0657.15R978.19文献标识码:A文章编号:1004-495200304-0098-03诺氟沙星norfloxacin,NF)又名氟哌酸,属于第三代喹诺酮类抗菌药物。由于本品具有抗菌谱广、副作用小以及与其它药物交叉耐药性较少等特点,广泛用于临床。其测定方法有非水滴定法紫外分光光度法21、荧光分光光度法3、极谱法4色谱法5-7等。用碳糊电极测定诺氟沙星未见报道。作者研究诺氟沙星在混合粘合剂碳糊电极上的伏安行为。1实验部分1.1仪器与试剂JP3-1型示波极谱仪山东电讯七厂),三电极系统,自制碳糊电极为工作电极,饱和甘汞电极为参比电极,铂电极为对电极;821型袖珍数字式pH酸度计中山大学电子厂诺氟沙星标准溶液(2.0mmol/L):准确称取0.069g诺氟沙星原料药(纯度为99.3%由广州市侨光制药厂提供),用2mL0.1mol/LHCl溶解,稀释至100mL,贮于棕色容量瓶中保存;SL十二烷基磺酸钠溶液(1.0g/L):称取0.10gSL(分析纯),用水溶解并稀释至100mL;石墨粉光谱纯,上海化学试剂站分装厂)液体石蜡分析纯广东汕头新宁化工厂);甘油(分析纯,广州化学试剂厂)其它试剂均为分析纯,溶液按常规方法配制,实验用水为二次蒸馏水。1.2液体石蜡-甘油混合粘合剂碳糊电极的制备1.30g石墨粉、0.46g液体石蜡、0.12g甘油混合搅拌均匀后,填入内径为4.0mm,长为50mm的玻管中,用玻棒压紧,插入银丝作导线,在光滑的纸上抛光,备用。1.3实验方法取1.8mLpH10.50的磷酸盐缓冲溶液、0.4mL0.02mol/LCl和0.4mL0.2g/LSLS溶液混合,加入适量的诺氟沙星标准溶液,混合均匀,稀释至10mL,用液体石蜡-甘油混合粘合剂碳糊电极作工作电极,在-0.70V处静止富集9s,记录阴极溶出伏安曲线,测量-1.61V处的导数波高。其中扫描范围为-0.70~-1.99V,扫速400mV/s收稿日期:2002-09-07;修回日期:2003-05-14作者简介:朱明芳(1970-),女,湖南邵阳人,讲师,硕士 namide adenine dinucleotide in oxidized form(NAD) catalyzed by alcohol dehydrogenase(ADH). The change rate of the absorbance of nicotinamide adenine dinucleotide in reduced form (NADH) was detemmined to obtain the velocity of the enzymatic reaction and the calibration curve of ethanol was drawn. The ethanol in samples was determined by the calibration curve. The effect of the pH and the inhibitor was discussed. The method is simple, rapid and accurate.