聚乙二醇-聚乙烯亚胺共聚物的制备及其表征

第45卷第6期中山大学学报( 自然科学版)Vol.45 No.62006年11 月ACTA SCIENTIARUM NATURALIUM UNIVERSITATIS SUNYATSENINov.2006聚乙二醇-聚乙烯亚胺共聚物的制备及其表征张璇，潘仕荣，吕澍，胡海梅，张未(中山大学附属第一医院，广东广州510080)摘要: 用亲水的聚乙二醇对聚乙烯亚胺进行改性，制备适用于基因转染的非病毒类载体。以异佛尔酮二异氰酸酯活化聚乙二醇，再与聚乙烯亚胺反应，两步法合成了聚乙二醇-聚乙烯亚胺(PEC-PE)嵌段共聚物，分别用IR、'H NMR、GPC、DSC对共聚物进行了表征。在IR谱图上可见mPEC-NCO中异氰酸基、及PEC-PEI中脉:基的特征峰;根据'H NMR谱图计算表明，此聚合反应为可控反应，通过调节PEC与PEI的投料比例可控制共聚物组成及相对分子质量; CPC曲线上共聚物为-单峰，与PEG和PEI均聚物峰位置不同，表明产物是PBEC-PEI共聚物，DSC分析也表明共聚物T。较均聚物均有不同程度的下降，这是PEG和PEI两种嵌段相互缠结的结果。因此证明成功合成了PEC-PEI 共聚物。关键词:聚乙烯亚胺;聚乙二醇;共聚物;异佛尔酮二异氰酸酯中图分类号: 0632. 12文献标识码: A文章编号: 0529-6579 (2006) 06-0053-05随着基因治疗的不断深人，非病毒基因载体的黏接剂， 具有柔软、耐水、耐油、耐热、无毒等特研究近年来取得了很大进展。阳离子聚合物是被广点， 已获得美国FDA的认可。2002 年，Pelesen'"泛研究的非病毒载体之一,通过其分子链上的正电用己二异氰酸酯(HMDI)作偶联剂制备了PEI-b-荷与DNA链上的负电荷的静电作用缔合并转变成PEG。IPDI 同HMDI相比2个一NCO基团的活性纳米级复合体"，保护DNA免受核酸酶降解。较低，反应速度较平稳，毒性较低:稳定性好、耐1995年，Bousift2-3) 首次报道了聚乙烯亚胺老化性能优、原料易得、反应简单，故用作本研究(polyethylenimine, PEI)可作为非病毒载体。PEI的偶联剂。本研究开辟了一条PEC-PEI共聚物的结构单体(- CH2- CH,-NH,-) 中每3个原子新的制备 方法。含-一个氮原子，可质子化生成正电性氨基，成为与1实验部分基因复合的作用点，在体内有较高的转染率。但是，因为PEI强的渗透作用，破坏细胞的溶酶体1.1 实验原料膜，显示出细胞毒性(4)，为了改善PEI的生物性聚乙烯亚胺(PEI, M. 25 000, Aldricb-Sigma能，采用引入PEC对其进行修饰，PEG 是无毒和公司产品，支链型，无水);聚乙二醇单甲醚抗免疫原性的水溶性大分子，有优良的生物相容(mPEG, M.为2000和5000, Fluka公司); 异佛性，通过PEG修饰PEI形成共聚物即可克服PEI尔酮二异氰酸酯(IPDI, 广州市汇采涂料化学品有DNA复合物溶解性差、细胞毒性大和传送过程中限公司,进口分装);二月桂酸二丁基锡( DBTL,沉积等不足[4)。用PEG修饰PEI的方法,国外报广东丽宝涂料助剂公司);氯仿(分析纯，广州试道多使用特异活性的PEG修饰剂，例如含琥珀酰剂二厂 ,用前用无水氯化钙干燥过夜，再在60 C亚胺酯端基的PEC15-6), 含环氧化物湍基的与IPDI回流4h,以除去微量的水和乙醇);乙醚PEC[",含醛基端基的PEG,它们的制备复杂，来(分析纯，广州试剂二厂);石油醚(30 ~60 C，源缺少，所得PEG-PEI共聚物的产率较低。分析纯，广州试剂二厂)。异佛尔酮二异氰酸酯(IPDI) 属脂环族二异1.2异氰酸酯单端基聚乙二醇的制备氰酸酯，其相对分子质量大，蒸气压低，毒性小，将mPEG先110 C脱水处理4 h,再用定量氯并且有良好的耐候性、耐热性和耐溶剂性8]，以仿溶解。称10倍摩尔量IPDI, 溶于氯仿，加入IPDI为原料制造的食品、医药、化妆品包装袋用0. 6%n70的化化刘NRTT收上述两溶液混合,中国煤化工TYHCNMHG收稿日期: 2006 -01 -22基金项目:国家自然科学基金资助项目(30570500)作者简介:张璇(1976 年生)，女，博士研究生;通讯联系人:潘仕荣; E-mail: gpshr@ 163. com54中山大学学报(自然科学版)第45卷75 C左右回流反应8 h,所得产物在石油醚中沉.的NCO的活性大8~10倍。用作偶联剂与PEG反淀，沉淀用氯仿溶解，再用石油醚沉淀，此操作重应时，脂链上的NCO在催化剂作用下先与- -0H复多次直至将过量的异佛尔酮去除干净，真空干反应后，脂环上的NCO就难于再与- -0H反应，燥，得白色蜡状至粉末状固体。故生成的预聚体副反应少。加入过量的IPDI可使1.3 PEG-PEI嵌段共聚物的合成反应进行的更加完全。而Petersen[9!使用的HMDI将PE1用20倍(质量比)氯仿溶解，磁力搅上的两个NCO为对称结构，活性相同，有可能同拌下将异氰酸酯活化的单甲氧基聚乙二醇的氯仿溶时和两个mPEG反应而无法再继续与PEI反应，本液逐滴加人PEI溶液中，再加人0.6% ~0.7% 的实验采用IPDI做偶联剂可避免此种情况。与PEI催化剂DBTL,置60 C回流反应16 h,蒸去多余氯反应前必须将过量的IPDI 除去，因为残留的IPDI仿，余下液体用大量乙醚沉淀，过滤，真空干燥，可使PEI大分子间形成交联而至使溶解性下降。称量。IPDI可溶于石油醚，而活化的PEG在石油醚中沉1.4表征淀0]，用大量的石油醚反复洗涤预聚体可除去1.4.1 IR 分析mPEG、 mPEG-NCO、PEG-PEI 样IPDI。活化的PEG不稳定，研究发现预聚体放置3品分别采用KBr压片制备; PEI 样品用其CHCl3液d后NCO的质量百分含量下降了一半以上，故在KBr晶片上涂膜制备，各样品的IR谱分析在PEG预聚体必须尽快和PEI进行反应。PerkinElmer 683型红外光谱仪上进行。将活化的PEG缓慢逐滴加入PEI溶液中，使.1.4.2 'H NMR测定以CDCI3为溶剂，温度26PEG与PEI充分发生共聚反应，避免局部浓度过C，在Brucker AM400型核磁共振仪上进行。高。生成的聚合物在乙醚中立即沉淀，而未反应的1.4.3 GPC 测定以聚苯乙烯作为标准物， 四氢PEI不沉淀可除去未反应的PEI。呋喃为流动相，流速1.0 mL/min,温度40 C,在2.2红外 光谱分析Waters515/410凝胶渗透色谱仪上进行。在图2(a)中，3300~3400cm-'的宽峰代1.4.4 DSC分析程序升温速率为10 C/min,在表N-H的伸缩振动, 2 900 cm-'峰代表亚甲基NETZSCH DSC204差示扫描量热仪上进行。C-H伸缩振动，表明聚合物PEI 中存在有--NH--和CH2，证实了PEI的(-CH2--.2结果 与讨论CH2- -NH2-)结构。图2 (b)中3 300~3 5002.1共聚物的合成cm~'的宽峰代表0-H的伸缩振动, 2 888 cm~'峰共聚物的合成路线如图1所示。代表亚甲基C- -H伸缩振动，1 108 cm~'峰代表在预聚反应中mPEG被活化，末端的羟基转变C--0醚键的吸收峰，说明mPEG 中有为异氰酸根的预聚体，此预聚体对PEI中的氨基有- -CH2- -CH2-0-和-0H的存在。图2 (c)较高的反应活性。IPDI 的2个异氰酸基连接方式和图2 (b) 相比，多了2267和1 719 cm~|两个不同，活性也不同，脂链上NCO的活性比脂环上Hc'0NCODBTLCHCINOCH0E cHCHoF. CH2ChOHCHO t cncnoF, CILCHO C -NHnCc kcHHgCCHNH2NHwEmnE N~JNNHENgENjJ..NH2cODBTLCHCIO中国煤化工CHO- E cncno子, CHCH20-C-MYHCNMHGH3C图1 PEG-PEI 共聚物的合成路线Fig 1 Synthetic scheme of PEC-PEI copolymer第6期张璇等: 聚乙二醇-聚乙烯亚胺共聚物的制备及其表征55峰,位于2267 cm~'峰代表未参加反应的脂环链上2.3 'H NMR的测定的NCO的伸缩振动, 1 719 cm -1峰代表生成的氨基图3-1中，a(δ 2.772)和b( 82.656)处的吸甲酸酯中C=0(酰胺I)的伸缩振动，表明收峰应归属分别与仲胺和叔胺相连的亚甲基质子mPEG发生预聚反应，- -OH转化为一NCO。图2(- CH2)的化学位移。图3-2中d(δ3.667),e(d)中3 410 cm~'峰应为0-H及N--H两峰的(δ 3.831)和f(δ 3.717)的峰均为mPEG中亚甲基叠加，此峰同样显得很宽。和2 (c) 相比，2 267质子(- -CH2)的化学位移,c(δ 3.387)处的吸收cm~处的0=C=N吸收峰消失，表明活化的峰为CH,0一中甲基的一-CH, 质子的化学位移。mPEC中的NCO与PEI反应完全，而1 700 cm~的图3-3同图3-2相比，主要在低场出现了一系列C=0氨基甲酸酯基峰仍存在并增加了脲基在峰，g(δ 3. 025 )处的吸收峰为与氨基甲酸酯基相连1 570 cm-'的伸缩振动，由此可初步确定共聚物的亚甲基质子(- -CH2)的化学位移,h(δ 2.964)PEG-PEI的生成。处的峰应为- -NCO相连的次甲基(- CH)质子的化学位移，i、j.k.1(δ 1. 700、1. 061、1. 200、(a) 心0.925)的几处峰均为环已烷上的亚甲基及与之相Www连的甲基上质子的化学位移。图3-4同图3-1和图3-3相比，既有PEG上质子的特征吸收峰c"、d"、e"、f"(δ3. 399.3.658.3.776.4. 112),又有PEIIMMC上质子的特征吸收峰a' b'(82.783.2.659),低场i'、j'、k'、I' (δ 1.701、1.063.1.232、0. 880)处还可(o)~1710见环已烷上的亚甲基及与之相连的甲基上质子的吸收峰，由此图谱可进- -步 确定聚合物为PEG与PEI12.r的共聚物。同时可根据共聚物中乙烯亚胺单元(δ2.5~3.0)和乙二醇单元δ 3.6中相关氢的积分面积之40000 3500 3000 2500 20001500 1000 500 0比计算出共聚物中两组分的质量比及相对分子质w/cm^量，见表1。图2均聚物 与共聚物的的IR谱图从表1中可以看出，由'H NMR所计算的不同Fig2 IR spectra of homopolymers and copolymers投料比所得的共聚物的实际组成与反应的投料比接(a) PEI, (b) mPEG, (e) mPEC-NCO, (d) PEG-PEI近，说明反应是一种可控反应，因此可通过改变反应物的投料比来调节生成共聚物的组成。PEIHN ENi.ENJ. NItmPEGCHO t cHCHO . CHCItOHNCOmPBG- NCO CtO E chHCHtoF. CiHCHO- NHAch 1,HCNHEiNyJ.EN J。NHh4CCPEG-PEI CHO f chciho王. cHCitoC -NH icX大10 86420,HCRCH了中国煤化工图3均聚物与共聚物的'H I.MHCNMHGFig3 'H NMR spectra of homopolymers und cwupunymers1、PEI2, mPEG 3, mPEG-NCO and 4 PEC PEI56中山大学学报(自然科学版)第45卷表1PEC-PEI共聚物的组成及相对分子质量Tab.1 Compositions and molecular weights of PEG-PEI copolymer反应物产物.名称r( PEG)w( PEG)M,(PEG) M,(PEI)修饰/% TDEOL w(PEI)/% M,(PEG-PEI)y/%r(PEI)w( PEI)PEI25 00000PEC-PEI(2-25-1)2 0004. 171/30.52.981. 1331 00079. 55PEG-PEI(2-25-2)12.51/11.810.554.414600075.0PEG-PEI(2-25-3)37.53/14.526. 032.5177 000PEG- PEI(5-25-1)5 0001.670.373.5334 00073. 86PEC-PE(5-25-2)500051. 247.241.06 .61 00075. 29PEG-PEI(5-25-3)153.5420. 619. 55128 00087.342.4 GPC 的测定图4a、b、c、d分别为PEI、PEG、PEC-PEI3.00| (a(2-25-2) PEC-PEI(5-25-2)的GPC图,曲线上共聚2.50物为一单峰，与PEI和PEC均聚物峰位置不同,2.00表明产物是PEG-PEI共聚物，没有PEG和PEI均1.50聚物的存在。GPC计算所得聚合物PEC-PEI(2-25-1.000.502)和PEG-PEI(5-25-2)的M。分别为44 740和0.0053 990，相对分子质量分布值分别为1.24和1.16。4.10 3.90 3.70 3.50~与'H NMR计算得到的相对分子质量相比，GPC 测2.50| (b得的聚合物的相对分子质量偏小，这是由于嵌段共聚物有着与GPC标样聚苯乙烯不同的流体力学行1.5为所致。本文研究的共聚物的相对分子质量以'HNMR的测定结果为准。2.5、共聚物的 DSC分析0.00 ;图5中a线的峰为mPEG结晶熔融的吸熱峰,享3.00 ()T.为66 C。b、c、d线共聚物的T.分别为52.7.50.2、49.3 C,较均聚物Tm有不同程度的下降，这是PEC和PEI两种嵌段的相互缠结的结果使结1.50 |晶度下降", PEI质量含量越高，T下降就越大。随着共聚物中PEI含量的增加，共聚物在低温-侧的峰面积逐渐减少，表明mPEG的结晶性被破坏。4.904.704.504.304.10同时高温一-侧127~128C出现的吸热峰强度随(d)PEI含量的增加而增大。由此表明共聚物存在微相分离，具有嵌段共聚物的特征。3结论将单甲氧基聚乙二醇用异佛尔酮二异氰酸酯活5.104.904.704.504.304.10化生成预聚体，再与聚乙烯亚胺聚合制备嵌段共聚lg M物，用IR、'H NMR、GPC、 DSC 对共聚物进行了GPC谱图表征。结果表明，生成了PEC-PEI共聚物，产物中国煤化工。3 and copolymers中无残留反应物，该聚合反应为可控反应,通过调YHC N M H GEI(2-25-2)节PEG与PEI的投料比例可控制共聚物组成及相and (d)PEC-PEI(5-25-2)对分子质量。PEG-PEI 嵌段共聚物有望成为新型非病毒基因载体材料。.第6期张璇等:聚乙二醇-聚乙烯亚胺共聚物的制备及其表征57[5] JUNG W H,JAE HP, KANG M H, et al. PEGylatedpolyethyleninine for in vivo local gene delivery based onlipiodolized emulsion system[ J]. J Controlled Release ,(2) mPEG(5000)2004, 99(1): 167- 176.[6] TANGA GP, ZENGA J M, GAOASJ, et al. Polyethy--(b) PEG-PEI(-25-3)lene glycol modified polyethylenimine for improved CNS(c) PEG-PEl(5-25-2)gene transfer: effects of PECylation extent[ ]. Biomate-rials, 2003, 24(13): 2351 - 2362. .-(d) PEG-PE(5-2S-1)7] SUNGSJ, MINS Y,CHO K Y, et al. Eleet of polyth--50_10150 2006rylene gycol on gene delivery of polyethyleni- mine[J].Biol Pharm Bull, 2003 , 26(4): 492 -500.图5 mPEG 及共聚物的DSC曲线[8] 钟立.异氰酸酯的合成与应用[J].化工进展,2000Fig5 DSC curves of mPEG and copolymers(4) :50-53.[9] PETERSEN H, FECHNER P M, MARTIN A L, et al.参考文献:Polyethyleninine-graf-poly( ethylene glycol) copolymers:influence of copolymer block stuture on DNA complex-[1] KAKIZAWA Y, KATAOKA K. Block copolymer micellsation and biological activities as gene delivery system[J].for delivery of gene and related compounds[J]. Adv DrugBioconjugate Chem, 2002 ,13(4): 845 - 854.delivery Reviews, 2002 ,54(2) :203 -222.[10] PETERSEN H, KUNATH K, MARTIN A L, et al.2] BOUSSIF 0, LEZOUALCH F, ZANTA M A, etal. AStar-shaped poly( ethylene glycol)- lock polyethy- leni-versatile vector for gene and oligonucleotide transfer intomine copolymers enhance DNA condensation of lowcells in culture and in vivo: polyethylenimine[J]. Procmolecular weight polyethylenimines [ J ]. Biomacro-Nat! Acad Sei USA, 1995, 92(16) :7297 -7301.mole, 2002, 3(S): 926 -936.[3] BOUSSIF 0, ZANTA M A, BEHR J P. Opimized galen-[11] 邓联东,孙多先,姚芳莲,等聚乙二醇-聚己内酯ics improve in viro gene transfer with cationic molecules三嵌段共聚物的合成与表征[J].现代化工,2003,up to 100-old[J]. Gene Ther, 1996 ,3(12): 1074 -23(6):35 -37.1080.[4] GODBEY W T, MIKOS A G. Poly( elbylenimine) and itsrole in gene delivery[J]. J Contolled Release, 2001 ,72(1-3): 115 - 125.Synthesis and Characterization ofPoly ( ethylene Glycol) - Polyethlenimine' CopolymerZHANG Xuan, PAN Shi-rong, L0 Shu, HU Hai-mei, ZHANG Wei(The No. 1 Afiliated Hospital, SUN Yat-sen University , Cuangzhou 510080, China)Abstract: PEI was modified with PEC in order to improve is physical properties for nonviral gene delivery. mPEGwas modifed with IPDI, which was reacted with PEI to synthesize the block copolymer of PEG-PEI. The copolymerwas characterized by IR, 'H NMR, GPC, DSC analysis. IR spectrum showed the absorption of the isocyanate ofmPEG-NCO and absorption of the urea bond of PEG-PEI. The results of 'H NMR analysis indicated the polymeriza-tion was a controlled reation, in which the composition and molecular weight of the copolymer could be contrlledthrouth adjusting ratio rates. The GPC of the copolymer exhibited only one peak different from that of PEG and PEIhomopolymers, ilustrating the product only contained PEC-PEI copolymer. DSC measurements of copolymershowed a shift of T。to lower values in comparison to the T. of PE中国煤化工antanglement of thetwo blocked chains. The results indicated the PEG-PEI block cosfully.THCN M H GowmsieKey words: polyethylenimine; monomethoxy ( polyethylene glycon, ,wpurylror, soupuun usocyanate