用聚乙二醇修饰大分子药物的研究进展

●696●中国医药工业杂志Chinese Jourmal of Pharmaceuticals 2004, 35(11)用聚乙二醇修饰大分子药物的研究进展王俊，裴元英*(复旦大学药学院药剂学教研室，.上海 200032)摘要:综述了近年来用聚乙二醇修饰大分子药物的条件、修饰后药物性质的改变及存在的问题和解决思路。关键词:聚乙二醇:修饰:大分子药物中图分类号: R944.9文献标识码: A文章编号: 1001-8255 (2004) 11-0696-06大分子药物主要包括酶、细胞因子等一些具有于蛋白质的二硫键和活性中心。Lys占蛋白质中所特殊功能的蛋白质，作用专一、高效，对人体健有氨基酸总量的10%，且较少参与构成多肽或蛋白康有重要作用。过去，多肽和蛋白质只能从天然物质的活性中心。因此，目前PEG通常修饰的位点质中提纯获得，随着基因工程的发展，这个障碍已是大分子表面Lys残基上的氨基，包括0x-NH2或ε-基本克服。但此类药物稳定性差、血浆半衰期短、具NH2。Bailon 等(对干扰素-0-2a进行PEG修饰，结有免疫原性,使其在生产和应用方面受到极大限制。果表明94%的修饰位点都集中在干扰素的Lys3、1970年代末人们用聚乙二醇(PEG)修饰牛肝过氧化Lys12I、Lys131、 Lys1344 个残基上，其余6%位于氢酶，改善其免疫原性和循环时间。1991 年PEG修Lys70和Lys3.若PEG与位于蛋白质活性中心的Lys饰的腺苷脱氨酶面市后，已陆续有PEG修饰的门冬残基连接，必然会影响生物活性，此时可选择带有酰胺酶、干扰素-a-2a和2b经FDA批准用于临床。羧基侧链的氨基酸残基为修饰位点，但必须考虑到目前，PEG 修饰技术正成为大分子药物传递系统研氨基酸自身的交联反应。在糖蛋白中糖基上也有一究的热点之一(1~3]。些修饰位点，如还原性的末端醛基、羟基等，在采用PEG进行结构修饰可改善药物的以下性一些特殊情况下还包括伯氨基、羧基、磷酸基。此质: (1)增加稳定性: (2) 改善药动学性质; (3) 降低外，糖的邻羟基较易被高碘酸氧化形成具有反应活免疫原性; (4)降低毒性，提高体内活性; (5) 改善.性的缩甲醛基[5]。体内分布。1.2活化的PEG修饰剂1 PEG 修饰的条件PEG末端的醇羟基化学性质不活泼，为保证其1.1药物的活性反应官能团与药物活性基团间有适宜的反应速率，需对醇羟基PEG与多肽或蛋白质的修饰反应属于亲核反进行活化，以利于与蛋白质的0-和ε氨基的反应。应。大分子药物C端的0:-COOH、N端的0-NH2及按PEG与蛋白质氨基形成的连接键类型，活化PEG赖氨酸(Lys)、门冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、精可分为以下两大类[6]:氨酸(Arg)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、色氨(1)烷基化PEG (alkylating PEGs，通过烷基键酸(Try)、甲硫氨酸(Met)、组氨酸(His)等9种氨连接)，如醛基化PEG (PEG aldehyde)、PEG-三氟基酸的侧链在- -定的介质环境中较易离子化而呈现乙基磺酸酯(2,2,2-trifluoroethanesulfonyl, PEG-T)亲核性，亲核活性由大到小依次为: R-S-> R-NH2和环氧烷基化PEG (PEG epoxide)。醛基化PEG可> R-C00-= R-O -。Cys的巯基是最易被修饰的氨通过氰基硼烷还原、与R-NH2形成Schiff氏碱得到，基酸残基，但Cys在蛋白质中的总量很少，通常位适中国煤化工大分子药物。但反应收稿日期: 2003-03-05速率THCNMHG长时间的反应有可能作者简介:王俊(1979)， 男，硕士研究生，专业方向:药物新使不想定的虫口庾大活。pH对反应的选择性有重剂型、新制剂研究。要影响，pH5 左右时醛基化PEG只与a-NH2反应。裴元英(1943)，女教授，药物新剂型、新制剂研究。PEG-T是另一种可保持含有正电荷活性中心蛋白质Tel: 021-54237186E-n啊內数塘hmu edu.cn活性的PEG修饰剂，但反应专属性不强、定性困中国医药工业杂志Chinese Journal of Pharmaceuticals 2004, 35(11)●697. .难。环氧烷基化PEG的反应速度也较慢，且其开作用保护蛋白质中易受各种蛋白酶攻击的区域。环生成的羟基有可能与蛋白质发生副反应。文献(9)采用加速振摇试验评价了未经修饰和采用(2)酰化PEG (acylating PEGs,通过酰胺键连不同分子量的单甲氧基聚乙二醇(mPEG)修饰的胰岛接)，其中大多是羧酸化PEG与N_羟基琥珀酰亚胺素的物理稳定性，以保留50%起始浓度的时间为表(hydroxysuccimide)所形成的活性酯(PEG-0-X-示样品物理稳定性的相关值。结果表明,mPEG与胰COOSu)，目前较常用的是PEG琥珀酰亚胺基琥珀岛素的苯丙氨酸B'位点共价结合产物的物理稳定性酸酯(PEG-succinimidyl succinate, PEG-SS) 和PEG比未修饰的胰岛素高36~40倍，且其稳定性随着琥珀酰亚胺基碳酸酯(PEG-succinimidyl carbonate,mPEG分子量的增大而延长。Croyle 等[101分别用氰PEG-SC)。研究表明，- _COOSu 基团与PEG连接尿酰氯(cyanuric chloride)活化的mPEG、PEG-SS和的最后--个烷氧基长度对其与氨基或水的反应活性PEG-T，对腺病毒进行修饰，置一20、4、25、有显著影响,如PEG-0-CH2-CH2-CH2-COOSu的水解42"C的磷酸钾缓冲液(pH7.4)中,进行为期6个月的半衰期为23h，而PEG-O-CH2-COOSu仅为0.75h。物理稳定性考察。结果表明，在各试验条件下，经此外，用氯甲酸酯活化的PEG与用琥珀酰亚胺活化mPEG修饰的腺病毒的物理稳定性显著高于未修饰的PEG相比，修饰反应速率低、可控性强，修饰的病毒，其中后两种活化mPEG修饰的腺病毒在室可具有一定的选择性:在水相-有机相体系中的反应温下24h内的效价几乎无损失，有利于腺病毒作为也较容易。病毒载体的使用。Soares 等1分别考察了用分子量2修饰度的测定方法为5000的PEG-SS修饰的门冬酰胺酶(PEG-L-多肽或蛋白质的修饰度指每个修饰产物上偶联asparaginase)对酸、热、酶的稳定性。结果表明，的PEG分子数。可通过三硝基苯磺酸法、铁氰酸经PEG修饰后，门冬酰胺酶的稳定性显著提高。胺法、荧光胺法测定未被修饰的氨基酸残基的量，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)结果显示，而间接得到蛋白质的修饰度。但千扰因素较多，灵pH3.5下PEG-L-门冬酰胺酶在lh内未发生变性,保敏度较低[6]。目前常用基质辅助激光解吸附飞行时持稳定。将其置65'C、pH6.8的50mmo/L Tris-HCl间质谱(matrix assisted laser desorption ionization time溶液中，Ih后生物活性仍可保留32%。在体外人of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS) [7]分血清培养试验中，其生物活性40min内无改变。离和检测。通过得到的分子离子峰及所用修饰剂的3.2药物动力学性质改善分子量,就可确定不同产物的修饰度。但由于仪器昂经PEG修饰后，许多蛋白质在体内的药物动力贵、样品需前处理，使其应用也受到了一定的限制。学性质都发生了显著改变，血浆半衰期明显延长，Sartore等8提出了一种 根据氨基酸测定多肽或蛋白肾清除率显著降低。目前认为这种变化主要是基于质修饰度的方法。正亮氨酸(Nle)是很少在多肽或以下3点: (1)许多经静脉给药的蛋白质很快被网状蛋白质中出现的氨基酸，所以可先合成PEG-Nle-内皮组织(RES)、肾、肝、脾消除，这种消除依OSu,用其修饰蛋白质，再用盐酸水解，通过测赖于蛋白质分子的大小、电荷及与特定细胞内受体定Nle的含量可计算得出修饰度。的亲和力，而用PEG修饰后，上述性质均发生了改3修饰后药物性质的变化变; (2)蛋白质易被体内的蛋白水解酶代谢，半衰期3.1稳定性增强和滞留时间较短，PEG 可利用空间位阻作用减少受某些物理和化学因素会改变或破坏蛋白质分子水解中国煤化工解: (3) 药用的非人的空间构象，导致其生物活性的丧失和- - 些理化性源性CHCN MH性，进入体内后易质的改变。亲水性PEG与蛋白质共价结合后，可被免疫系统清除，PEG 的空间位阻作用可掩蔽蛋白使蛋白质颗粒表面形成较厚的水化层，阻止其凝质上的抗原决定簇，从而减少被免疫系统清除的几集、沉淀。此外，PEG的柔性链可通过空间位阻率[9,12]。●698●中国医药工业杂志Chinese Journal of Pharmaceuticals 2004, 35(11)Pepinsky等(13)采用分子量为20000的乙醛化PEG细胞体外集落形成能力的影响。结果表明，修饰后对重组人干扰素-β-1a进行修饰，并以猴、大鼠、细胞表面的CD3、CD4和CD8抗原的相对荧光强度小鼠为模型动物，静脉或皮下注射给药，考察其体明显下降，mPEG的浓度越大，遮蔽效果越好。体内药动学性质。在所有模型中,血浆半衰期平均增加外人干细胞培养试验表明，用不同浓度mPEG修饰5倍，清除率为原先的1/10， 分布体积明显减小，的淋巴细胞组培养，形成的粒细胞-巨噬细胞集落可推断干扰素经PEG修饰后减少了在血管外的分形成单位(colony forming unit-granulocyte布。Cohen等[41分别考察了用分子量为5000和20000macrophage, CFU-GM) 数量与对照组无显著性差的PEG修饰的重组人乙酰胆碱酯酶(rHuAChE)在异，说明mPEG修饰后几乎可完全遮蔽其表面抗原，小鼠体内的药动学行为。结果表明，PEG 20000-但不影响干/祖细胞在体外的增殖、分化能力。He .rHuAChE(4: 1)组的平均滞留时间(MRT)是未经修等[18]在天花粉(trichosanthin, TCS) 的PEG定位修饰的rHuAChE的50倍，这种显著的改变可能取决饰研究中，采用聚合酶链反应制备了S7C、Q219C、于连接到酶上的PEG分子的大小和个数。此外，K173C和[K173C，Q219C] (KQ)4种TCS的突变PEG-rHuAChE的表观分子量与其在体内的MRT有体，分别采用分子量为5000和20000的PEG进行修一定的线性关系。 Li 等[5采用分子量为5000、12000饰，考察PEG-TCS在小鼠体内的免疫原性。结果表20000的PEG-SS修饰重组人肿瘤坏死因子-0明，采用PEG 20000修饰后的所有TCS突变体在小(rHuTNF-ax)。结果表明，其在小鼠体内的半衰期鼠体内诱导的IgG和IgE滴度均显著降低。均显著延长，其中PEG 20000-rHuTNF-的半衰期3.4毒性降低， 体内活性增强(24.8h)是未修饰(28.8min)的50倍。Trakas 等[16)采Tsutsumi等[19]首先制备了-种重组的免疫毒用马来酰亚胺化PEG (PEG- maleimide)为修饰剂，素，该免疫毒素由两部分组成:抗人Tac单克隆抗体制备了带有2个鼠源性抗乙酰胆碱受体(AchR)主要的单链Fv片断和一段38kD的假单胞菌外毒素免疫原性区域(main immunogentic region, MIR)的单(Pseudomonas exotoxin, PE) 片断[anti-Tac (Fv)-克隆抗体Fab片段。大鼠体内的药动学试验表明，PE38，LMB-2]。 然后对其进行PEG定位修饰。结未经PEG修饰的Fab片段在3~6h内很快被清除;果表明，修饰后的药物在小鼠体内的毒性明显降低，而修饰后半衰期则显著延长至30h左右，与AchR的PEG- LMB-2的LDso(3.0mg/kg)是LMB-2的结合能力未发生显著改变,而免疫原性则显著降低。(0.5mg/kg) 的6倍。此外，PEG-LMB-2 在荷Tac-43.3免疫原性降低肿瘤的小鼠体内的抗肿瘤活性是LMB-2的3倍。现在临床上使用的蛋白质类药物大多是非人源Eliason等[20)制 备了PEG修饰的重组人粒细胞集落刺性的，重复给药后会在- -定程度上诱导机体产生免激因子(rHuG-CSF)，考察其在猕猴体内的药物活疫反应，从而影响疗效。用PEG修饰能掩蔽蛋白质性。结果表明，修饰后药物的体内活性显著增加,其表面的抗原决定簇，降低免疫原性。中PEG 2000-rHuG-CSF单剂量肌注6d后，血中嗜文献91采用酶联免疫吸附试验(ELISA)评价了4中性粒细胞水平与rHuG_CSF连续注射6d相当。种PEG修饰的胰岛素在小鼠体内的免疫原性和抗原Matousek等(1以荷黑色素瘤的无胸腺裸鼠为动物模性。结果表明，PEG修饰的胰岛素与抗IgG抗体的结型，研究经PEG修饰的牛胰核糖核酸酶(bovine合能力显著下降，mPEG的分子量为2000时，修饰pancreatic ribonuclease, RNase A)和牛精液核糖核物的免疫原性几乎不存在。这为解决胰岛素使用中酸醐中国煤化工Ise, BS-RNase) 在裸出现的诱导机体产生变态反应和抗体介导的内源性鼠仫:TYHCN MH C表明，未经修饰时，胰岛素分泌抑制等问题提供了良好的解决途径。张RNase A对肿瘤的生长没有实质性的抑制作用，而全等17]采用mPEG修饰脐血淋巴细胞，并观察修饰BS-RNase则具有较高的抗肿瘤活性;用PEG修饰后对淋巴细胞表面某些抗原的遮蔽作用及造血干/祖后，RNase A的抗肿瘤活性明显提高，与BS-RNase中国医药工业杂志Chinese Journal of Pharmaceuticals 2004, 35(11)_●699●的活性相近。但修饰后两者的免疫原性基本不变。可能阻止底物与蛋白质活性中心的位点结合，从而3.5体内分布改善影响被修饰蛋白的生物活性或与受体结合的能力。由于大多数大分子药物的分子量在10000~这一缺点大大制约了PEG修饰技术在大分子药物中30000内，全身给药后能通过肾小球滤去。与PEG的应用，目前各国研究者正在设法解决这一问题。结合后，分子量增大，可防止其从肾小球毛细血管4.1.1引入可逆的位点保护基团中渗出，减少在尿中的排泄量。同时，用PEG修饰可选用一些对于蛋白质活性位点有特殊亲和力后可提高大分子药物在体循环中的稳定性，延长在的底物、抑制剂等，在PEG修饰反应前对活性位点体循环中的滞留时间，有益于改善药物的体内分布，进行保护，修饰后再脱去保护基团。Caliceti 等[261尤其有利于大分子药物在具有渗透和滯留增强效应首先将胰蛋白酶(trypsin)抑制剂苯甲脒(benzamidine)(enhanced permeability and retention effect, EPR) 的共价结合到琼脂糖凝胶树脂上,在适宜的pH和离子肿瘤以及炎症部位的蓄积(231。强度下，与胰蛋白酶的活性位点结合,再进行PEG修鲑降钙素(salmon calcitonin, sCT)在肾脏中迅速饰反应，最后通过改变pH将修饰产物从树脂上洗脱代谢为无活性的小片段，占体内总代谢的2/3。Yoo下来。作者比较了PEG修饰前经苯甲脒保护和未保等[24)用分子量为5000的mPEG-SC修饰sCT,采用护的胰蛋白酶的水解活性。结果表明，分别以酪蛋氯胺T法标记PEG-sCT和未经修饰的sCT,考察其白和牛血清白蛋白为底物时，前者的活性为95%和在大鼠体内的分布。结果表明，单-和二-PEG-sCT45%，而后者为28%和0。Tsunoda 等[27)采用可逆(分别表示sCT上连接了1种和2种PEG)在肾脏中的的氨基酸保护剂二甲基马来酐(dimethylmaleic分布明显比未经修饰的sCT低，二-PEG-sCT在肝anhydride, DMMAN)在PEG修饰前对肿瘤坏死因脏和脾脏中的分布也显著减少。二-PEG-sCT与sCT子-ax(TNR-a)进行保护，结果显示经DMMAN保护的消除半衰期分别为(107.2士32.8)和(59.8土45.2)的PEG-TNF在雌性小鼠体内抗Meth-A纤维素肉瘤min，稳态分布体积(V.)分别为(229.9士68.3)和的活性是未保护的PEG-TNF的2倍。(603.1土332.3) ml/kg。Caliceti 等[21制备了PEG修4.1.2 选择合适的PEG类型饰的蛋清抗生物素蛋白(egg white avidin)，考察了其目前采用的PEG修饰剂主要有线形和分枝状两在荷Erlich实体瘤小鼠体内的分布。结果表明，PEG大类。分枝状PEG由于其空间位阻效应，只能与易修饰后药物在肝、肾中的分布显著减少，其中用接近的氨基酸残基反应，因此可较大程度地保留蛋PEG 20000修饰的药物在小鼠尾静脉给药15min后，白质的生物活性。Veronese 等[28]采用分枝状的肝和肾中的分布仅为原药的1/8~ 1/7;在肿瘤组织Lys (PEG)2(表示Lys.上连接2种PEG)修饰尿酸酶中的分布明显增加，用分子量5000、10000、 20000(uricase)，当修饰度为30%时，修饰产物可保留的PEG修饰的药物在肿瘤中的分布量分别是4%、5%32%的生物活性。而采用线形的mPEG修饰的产和8%，其中用PEG 20000修饰的在肿瘤中的高蓄物，在修饰度为20%时，仅保留2.5%的生物活性。积浓度(> 6%)可维持72h。Li 等[15)考察了未修饰4.1.3 PEG欠量的修饰反应(stoichiometric deficiency)和用PEG修饰的rHuTNF a在荷S- 180实体瘤小鼠体根据蛋白质与PEG的化学计量关系，在投料时内的分布。结果显示，给药后6h,后者在血液和肿使多肽或蛋白质过量，可使反应主要集中在高亲核瘤组织中的蓄积量明显大于前者，其中PEG 20000-活性的氨基酸残基上，从而减少活性中心上低反应rHuTNF-a在肿瘤组织的分布量为前者的5倍。活性中国煤化工性。此外，反应后4存在的问题与解决思路进行DTHCNM H G生物活性，找出生4.1对蛋白质活性位点的保护物活性最高的，并进行开发。Veronese 等[6]采用PEG可防止蛋白水解酶或抗体对多肽或蛋白质PEG欠量的修饰反应，结果只得到了在12、21位某些片段的攻击，保持大分子药物的稳定性，但这也单PEG修饰的异构体，其中的一个修饰产物经证实中国医药工业杂志Chinese Journal of Pharmaceuticals 2004, 35(11)具有较高的生物活性。-种新型给药系统[J].中国药学杂志, 2001, 36(5):4.1.4定位修饰技术292-296.利用不同氨基酸残基反应活性的差异，控制反[3]姜忠义,高蓉, 许松伟,等药物蛋白的聚乙二醇修饰[J].应条件使修饰反应只发生在某些氨基酸残基上。Cys中国药学杂志2002, 37 (6): 409-412.中巯基的亲核活性最强，通过蛋白重组技术可在蛋[4] Bailon P, Palleroni A, Schaffer CA, et al. Rational design of白的非活性区域引入Cys，可使大部分修饰反应都a potent, long-lasting form of interferon: a 40 kDa branched集中在该氨基酸上,从而起到保护活性中心的作用。polyethylene glycol-conjugated interferon a 2a for the treat-Goodson等[29]通过重组技术把Cys残基引入白介素ment of hepatis C[J]. Bioconjugate Chem, 2001, 12(2): 195-202.(rIL-2)的非活性单糖基化位点，采用马来酰亚胺活化的PEG (PEG maleimide)对其进行修饰。结果表[5] Veronese FM, Morpurgo M. Bioconjugation in pharmaceuti-cal chemistry[J]. Fammaco, 1999. 54(8): 497-516.明，PEG-Cys-rIL-2 与IL-2具有几乎相同的生物活[6] Veronese FM. Pepide and protein PEGylation: a review of性，而前者在体循环中的滞留时间是后者的4倍。problems and solutions [J]. Biomaterials, 2001, 22 (5): 405-4.2聚乙二醇的原料质量(301417.在修饰反应前，需先对PEG末端的醇羟基进行[7]蔡 耘基质辅助激光解吸附 飞行时间质谱(MALDI-TOF-活化。为避免在修饰过程中发生交联和团聚,常采用MS)在生物工程产品质量控制中的应用[].生物工程进展,mPEG作为修饰剂的合成原料。不同的聚合工艺和1996, 14(4): 23-25.不同来源的mPEG的分散性不同，mPEG的分散性[8] Sartore L, Caliceti P, Schiavon 0, et al. Accurate evaluation高，修饰物的均- -性难以保证。因此,建议先通过质method of the polymer content in monomethoxy (polyethylene谱或凝胶过滤色谱分析确定出不同来源的mPEG聚glycol) moified proteins based on amino acid analysis[I].合物的分布宽度指数Mw/M.的值，据此选购mPEGAppl Biochem Biotechnol, 1991, 31 (3): 213-221.原料。另外，由于聚合过程中少量水的存在，mPEG[9] Hinds KD,Kim SW. Effects of PEG conjugation on insulin产品中有1% ~ 15%的PEG二醇(OH-PEG PEG-OH)propertiesl[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2002, 54(4): 505-530.杂质。其含量取决于mPEG的分子量，分子量越小，[10] Croyle MA, YuQC, Wilson JM. Development of a rapid method二醇的含量越低。二醇在mPEG的活化过程中会产生for the PEGylation of adenoviruses with enhanced transduc-交联或团聚。若mPEG产品中存在二醇，凝胶过滤tion and improved stability under harsh storage conditions[J].Hum Gene Ther, 2000, 11(12): 1713-1722.色谱图谱上就会出现一个位于主峰前的小峰，分子量恰好是mPEG的2倍;通过峰面积可确定相应的[11] Soares AL, Guimaraes GM, Polakiewicz B, et al. Effects ofpolyethylene glycol atachment on physicochemical and bio-二醇含量。logical stability of E. coli L-asparaginase[J]. Int J Pharm,5结语2002, 237(1-2): 163-170.PEG修饰技术近年来发展较快，除用于修饰多12] 成军.长效干扰素治疗慢性丙型肝炎的效果评价[J].国肽和蛋白质以外，也用于核酸、脂质体、纳米粒等的外医学一-流行病学传 染病学分册, 2001, 28(2): 60-63.修饰。随着新的修饰剂和修饰技术的研究,将会极大[13] Pepinsky RB, Lepage DI, Gill A, er al. Improved pharmnacoki-地促进大分子药物的临床应用。netic properties of a polyethylene glycol-modified form ofinterferon-B-Ia with preserved in vitro bioactivity[J]. J参考文献:中国煤化工3): 1059-1066.6[1Veronese FM, Harris JM. Introduction and overview of.MHCN M H G.eral Efce of cemicalpeptide and protein pegylation[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2002,modification of recombinant human acetylcholinesterase by54(4): 453-456.polyethylene glycol on its circulatory longevity[J]. Biochem[2]印春华, 张敏. 蛋白质和多肽类药物的聚乙二醇结合物J, 2001, 357(3): 795-802.中国医药工业杂志Chinese Journal of Pharmaceuticals 2004, 35(11).●701●[15] Li YP, Pei YY, Zhou ZH, et al. PEGylated recombinant[23] Maeda H. 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Adv Drug Deliv Rev, 1998, 34(1): 93-108.的问题和对策[J].药学学报, 2002, 37 (5): 396 400.Progress of PEG Modified of Macromolecular DrugWANG Jun, PEI Yuan- Ying*(Dept. of Pharmaceutics, Fudan University, Shanghai 20032)ABSTRACT: The preparation condition and properties of polyethylene glycol modified macromolecular drugs andthink over problems are reviewed.Key Words: polyethylene glycol; modification; macromolecular drug中国煤化ino的B35-30一种新的制备交联酶聚集体的交联方法学MateoC 等联剂可THCNMHG素G酰化酶CLEAS的活[Biotechnol Bioeng, 2004, 86(3): 273]性位点调定法亚不，用雨来糖来腔TF为文联剂使活性位点的损失通过沉淀和用葡聚糖聚醛交联的方法，以青霉素G酰化明显降低，而使CLEAS的活性更高。原因可能是大分子交联剂酶、羟基腈裂合酶、乙醇脱氢酶和两种不同的腈水解酶制备了交不能穿透蛋白活性位点，而与催化必需的氨基酸残基反应。联酶聚集体(CLEAs)。与常用的戊二醛相比，用葡聚糖聚醛交[龚家玮译朱春宝校]