Xenorhabdus nematophila发酵动力学研究

生物数学学报2007,22(2):243-250 BiomathematicsXenorhabdus nematophila发酵动力学研究王永宏张兴(西北农林科技大学无公害农药研究服务中心,陕西杨陵712100)摘要:在分批发酵中,研究了 Xenorhabdus nematophila YL001的生长、基质消耗及抗菌物质产生的特性,基于 Logistic方程和 Luedeking- Piret方程,得到了描述分批发酵过程的动力学模型及模型参数,同时对实验数据与模型进行了验证比较.模型计算值与实验数据拟合良好,模型基本反映了 Xenorhabdus nematophila yL001分批发酵过程的动力学特征.分批发酵中细胞生长与产物合成属于偶联型关键词: Xenorhabdus nematophila;发酵动力学;数学模型中图分类号:TQ92MR分类号:92C40;92C45文献标识码:A文章编号:1001-9626(2007)02-0243080引言Xenorhabdus属细菌与昆虫病原线虫 Steinernema共生,属肠杆菌科叫.线虫携带共生菌通过气孔、肛门、节间膜等自然孔口进入昆虫体内,将共生菌释放到昆虫的血腔中,共生菌在其中大量繁殖,产生毒素和抑菌物质,使昆虫患败血症,一般在48小时内死亡.共生菌具有多种生物学功能,在昆虫病原线虫的大规模生产中,共生菌不仅可直接作为线虫的营养源,而且可分解寄主组织和培养介质,为线虫的生长、繁殖提供营养;共生菌的次生代谢产物具有抑菌2,、杀虫国、杀线虫和抗肿瘤间等多种活性;在医疗卫生和农业领域具有较大的应用前景和商业潜力微生物反应动力学包括细胞生长动力学、基质消耗动力学和代谢产物生成动力学.通过发酵动力学的研究和发酵模型的建立,能更好的认识微生物发酵过程中菌体的生长和产物形成的机制,以及影响这些机制的一些重要环境因素,最终实现发酵过程的有效控制,达到提高产物发酵指标的目的.本文对X. nematophila Yl001的发酵动力学进行了研究,并对动力学方程进行了模拟1材料与方法11试验材料(1)供试共生细菌收稿日期:200603-27中国煤化工基金项目:国家863项目“昆虫病原线虫共生菌杀虫、杀菌剂的CN MH GAA241140)作者筒介:王永宏(1968-),男,陕西凤翔县人,副教授,博士. E-mail: hwang68@126com*通讯作者生物数学学报第22卷昆虫病原线虫共生菌X. nematophila YLool从其寄主线虫 Steinernema sp中分离鉴定获得(2)指示菌蜡状芽孢杆菌 Bacillus cereus由西北农林科技大学无公害农药研究服务中心提供(3)培养基斜面及平板培养基:NA培养基,牛肉膏3.0g、蛋白胨50g、营养琼脂20g、水1000ml、pH72~74;共生菌鉴别培养基:NBTA培养基,NA+(TTC0.04g、BTB0.025g);发酵培养基:葡萄糖6.13g/L、蛋白胨21.29g/L、MgSO41.50g/L、(NH4)2SO4246g/L、KH2PO40.86g/L、K2HPO41.1g/L、Na2SO41.72g/L、水1000ml,pH72~74.12试验方法(1)共生菌的培养种子培养:将种管保存的X. nematophila yl001,划线于NA培养基平板上活化,28°C培养24~48h,从生长良好的活化平板上挑取单菌落,再划线于NBTA培养基平板上,28°C培养24~48h,观察菌落的颜色变化,区分初生型和次生型共生菌.菌落为蓝色,周围培养基中的染料被吸收变为黄色的为初生型;菌落为红色,周围培养基中的染料不被吸收而保持蓝色的为次生型.用接种环挑取初生型菌,接种于摇瓶发酵培养基中,28C、180r/min振荡培养16h发酵罐培养:使用镇江东方生物工程设备技术公司生产的GUJS-7B型L全自动控制发酵罐进行分批发酵.发酵罐容积江L,两层六平直叶搅拌,三挡板.装料系数07,接种量9%,发酵温度26~28°C,通气量25L/min,搅拌转速300rpm,发酵过程中流加泡敌消泡(2)发酵过程参数检测OD的测定:取不同时期的培养液,用分光光度计在600m测定发酵液OD值DCW的测定:在一定的细胞浓度范围内,光密度与细胞浓度成正比,因而通过建立光密度与细胞干重的直线回归方程来测定发酵过程中的细胞干重(DCW)pH测定:由pH电极在线测定发酵过程中的pHDO测定:复膜氧电极在线测定发酵过程中的溶解氧DO还原糖测定:采用3,5二硝基水杨酸法(DNS)测定培养过程中还原糖的变化动态氨基氮测定:采用甲醛滴定法测定培养过程中氨基氮的变化动态抑菌活性测定:用管碟法测定X. nematophila YL001的抑菌活性.将熔化的NA培养基冷却至45°C~50°C,加入指示菌(1.5%V/V)摇均,每皿(d=9.0cm)倒入15ml培养基,制好平板后,用打孔器(直径75mm)在平板上均匀的打三个孔,每孔内加入1004l共生菌发酵液无菌滤液,以培养基为对照,在28°C培养24h,测量抑菌圈直径x. mematophilaYl001抑菌活性单位定义:在上述测定条件下,1004发酵滤液抑菌圈直径为105mm时定义为1个活性单位(U),即此发酵液活性为1m1成1m00/(3)数据处理方法中国煤化工模型参数的优化及方程组的求解均利用DPS软亻CNMHG第2期王永宏等: Xenorhabdus nematophila发酵动力学研究2结果与分析21江L发酵罐中X. nematophila YL001的分批发酵分批发酵的实验结果见图1.由图可以看出YL001菌株的细胞生长曲线比较明显.0~6h为生*太义半1长迟滞期,063)0为指数生长期,细胞生长在30达到稳定生长期,此后细胞生长量基本维持不变,DCW57h达到最大,为1958g/L.从抑菌物质活性单位变还原糖14X-PH化曲线图可以看出,其变化过程与生物量的变化趋势非常接近,抑菌物质活性单位在48h达到最大,为06121824303642485460667223.2U/ml,此后抑菌物质的活性单位下降较慢,保持图1x. nematophila yloc的分批发酵曲线在较高水平.从葡萄糖消耗曲线可看出,葡萄糖的利用基本上与细胞生长呈影镜关系,而从生长曲线与活性单位曲线的关系可以反应出抑菌物质的产生伴随着细胞的生长,因此预计Xnematophila YL001生产抑菌物质的发酵类型可能属于生长关联型.22动力学模型的建立(1)生长动力学描述菌体生长最常用的模型为 Monod方程,该模型为典型的决定论均非结构模型,而且最简单.它是基于以下假设建立的:(1)菌体生长为均衡型非结构式生长,细胞成分只需要用个参数即菌体浓度表示即可;(2)培养基中只有一种底物是生长限制性底物,其它营养成分不影响微生物生长;(3)将微生物生长视为简单反应,并假设菌体得率为常数,没有动态滞后0.10.显然(2)、(3)不符合共生菌发酵的特征,采用 Monod方程有偏差.结合菌体生长的特性图1)和多批次发酵结果,发现该菌在发酵过程中,在一定发酵条件下,菌体的生长有一最大浓度. Logistic方程可以很好地解释这一现象Logistic模型是一个典型的S型曲线,能很好地反映分批发酵过程中因菌体浓度的增加对自身生长存在的抑制作用,能较好地拟合分批发酵过程的菌体生长规律dt Amax/I-rdXX(1式中,max:最大比生长速率(h-1);X:菌体浓度(g/L);t:时间(h),当t=to时,X=X0,将(l)式积分得:2)产物生成动力学模型微生物产物形成过程非常复杂,为便于研究,d之间的关系,将其分为三种类型:(1)相关模型,是H中国煤化工与细胞生长速率CNMHG长相关的过程,此时产物通常是基质的分解代谢产物,代谢产物的生成与细胞的生长是同步的;(2)部分相关246生物数学学报第22卷模型,该类反应的生成与基质消耗仅有间接的关系,在细胞生长期内,基本无产物生成;(3)非相关模型,产物的生成与细胞的生长无直接联系,它的特点是当细胞处于生长阶段时,并无产物积累,当细胞生长停止时,产物却大量生成dPdx⊥3x式(3)为 Luedekin-Piret's方程,式中a≠0、B=0可表示I类发酵;a≠0、≠0可表示Ⅱ类发酵;a=0、≠0可表示Ⅲ类发酵,由于 Piret's方程既能反映出伴随着菌体生长产物的形成速度,也能反映出独立于菌体之外,细胞催化底物形成产物的速度.因此, Piret'方程原则上均适用于一般的发酵过程通过共生菌发酵过程分析及特征(1)可以看出,抑菌物质的产生与菌体生长有直接相关性,即产物的生成与底物的消耗是直接的关系.为了进一步验证产物形成与菌体生长的关系,对相关模型和部分相关模型均进行了分析(1)部分相关模型dp dX+BX稳态时,dX=0,x=xnm,则上式可变为:以t=0时P=0为初始条件,将式(4)代入式(3),积分后得:P=aXoIn(1-em-ekmaxpma式(⑤5)可写成如下形式:P=aA(t)+BB(t)其中,A(t)=Xo(1umaxXB(t)XAmaxl(1-xm(1-c)式(6)中B可由式(4)得到,mar、Xmax、X0均已知,以(P-BB(t)对A(t)作图,直线斜率即为a值根据实验结果,接种后0~36h是菌体生长期,36~72h是抑菌物质稳定合成期(图1)当菌体生长处于稳定期时,dX/t=0,X=Xmax中国煤化工,取抑菌物质稳定合成期抑菌物质的活性单位P对时间t作图,利CNMH得到两者关系为:P=24436-0.025833,相关系数R=0505抑函砌质根足台城期御图物质的活性单位P与时间t无线性相关关系.因此,不宜用部分相关模型表示抑菌物质的形成规律第2期王永宏等: Xenorhabdus nematophila发酵动力学研究247(2)相关模型在相关模型中产物生成速率与菌体生长速率成线性关系:d dx对式(7)积分可得产物生成动力学模型P= Po+a(X-Xo将式(2)代入式(8)可得XP=a根据相关模型方程(9),以产物生成速率dP/对菌体生长速率dx/t进行线性拟合,得到两者关系为:P=0.168783+2.0028,相关系数R=0.9072,由此可见,利用相关模型方程(⑨)对整个发酵过程产物生成数据拟合偏差较小,该模型适合用于表示抑菌物质生成规律分析过程也进一步验证了图1中关于X. nematophila YL001生产抑菌物质的发酵类型可能属于生长关联型的推论(3)基质消耗动力学模型在YL001菌株的发酵过程中,基质(葡萄糖)的消耗主要用于:(1)构成菌体成分;(2)维持菌体生长和代谢的需要;(3)合成抑菌物质.因此,基质消耗的方程可表示为:dsdsdtdtdt即ds1 dXdt1 dP+mX(10式中S为基质浓度(g/L),X为细胞浓度(g/L),P为抑菌物质活性单位U/m),m为细胞的维持系数(1),Yx/s为菌体相对于基质的得率系数(g/g),YP/s为抑菌物质活性单位相对于基质的得率系数(g/g)将式(7)代入式(10)后得dsdXXdtYxISdt(11)P/S式(11)可简化为:dsdXdt(12)中国煤化工其中,CNMHG248生物数学学报第22卷6P/S稳态时=0,X=Xmax,由式(12)得:a})将式(2)代入式(13)后积分得S=So-YXomaxIn(1Amax式(1)、(7)、(12)构成了X. nematophila YL001发酵过程中菌体生长、抗菌物质形成及基质消耗的动力学模型,式(2)、(9)、(14)分别为3个模型的积分形式以上各式描述了发酵过程中X. nematophila YL001菌体生长及抗菌活性单位的变化规律.23模型求解将上述模型根据实验数据在计算机上模拟求解,得到模型中的各个参数及初始条件见表因此,菌体生长动力学模型为:dXds0.1361×(1X18.50733抗菌物质产生动力学模型为.dP=2.0028×ddXdtdX基质消耗动力学模型为:-d:=039838×d+043x表1动力学模型参数Table 1 Parameter values in the kinetic models for Xenorhabdus nematophila batch fermentationParametersCalculated data1.83406/Lg/L0.131612.0028U/g细胞0.00443g葡萄糖/(g细胞.b)0318987g葡萄糖/(g细胞)2.4模型的验证在已知实验条件下,进行分批发酵的重复实验,中国煤化工合成及底物消耗的变化曲线,并对分批发酵的实验值与各动力学模CNMH如图2,3,4的结果第2期王永宏等: Xenorhabdus nematophila发酵动力学研究≥实验值实验值拟合值00612182430364248546066720122436486072图2菌体生长的发酵实验值与模型计算值的比较图3抑菌物质活性单位的实验值与模型计算值的比较从图可以看出,细胞生长的实验值与模型拟合结果能较好地吻合;在产物合成的拟合中,模型仅能6基本描述抑菌物质的产生过程.在发酵前3h能较好5◆实验值拟合值地拟合模型抑菌物质的实际产生过程.但在36h后实验值出现了急剧的降低,其原因可能是:抑菌物质言2是由多种成分组成,且发酵是一个非常复杂的过程,在抑菌物质生产过程中不仅有合成还有分解,尤其是3648当外界环境条件不利于抑菌物质稳定时,因此,在图4葡萄糖消耗的横型值与实验值的比较描述抑菌物质的产生时不能单纯地只考虑细胞生物量的情况,还必须考虑抑菌物质的组成成分、菌体的自溶和不利的外界条件等对产物分泌的影响;对于底物碳源消耗的拟合过程,在发酵前30h过程中,经计算该模型方程与实验值偏差在15%以上,在发酵30h后模型能够很好地描述实验值3讨论通过X. nematophila Y001发酵动力学的研究,拟和出其细胞生长、产物形成及基质消耗的动力学方程,能基本反映YL001菌株的发酵过程微生物反应过程非常复杂,该过程既包括细胞内的生化反应,也包括胞内与胞外的物质交换,还包括胞外的物质传递过程.要对这样一个复杂的体系进行精确的描述几乎是不可能的特别是在分批发酵过程中建立机制模型几乎是不可能.为了工程上的应用,首先要进行合理的简化,从模型的简化考虑一般釆用均衡生长的非结构模型,即在细胞的生长过程中,细胞内各种成分均以相同的比例增加,视菌体为单组份,不考虑环境对菌体组成的影响101.本文建立的模型均基于均衡生长的非结构模型假设目前,国内外生化工程学者所构建的模型大多属于数学拟合模型和正规模型,数学拟合模型应用最为广泛.其中,数学拟合模型建模较为简便,便于分析验证,易实现计算自动化.这些模型从本质上讲是对分批发酵过程总体现象和行为的描述,是一种现象模型.从工程角度出发,建立模型是为了更深刻地了解微生物复杂的反中国煤化工到,建立最优的操作条件,并为反应器的优化和控制服务.一个好的现NMHG正:(1)模型能够定量的描述发酵过程的变化;(2)主要影响因子的作用能够在模型甲反映出来.本研究所建250生物数学学报第22卷立的动力学模型基本具备以上两个特征,能较好的描述X. nematophila Y001发酵过程的变化,特别是细胞生长模型,但产物生成和基质消耗的动力学方程的模型预测值与实验值有一定的偏离,这可能是由多种原因造成的,如抑菌物质的组成成分、菌体的自溶和不利的外界条件等对产物分泌的影响等.因此需要在以后的研究中根据抑菌物质的合成、基质的消耗规律不断去修正所建立的动力学模型参考文献(1 G M, Poinar G O. 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Withthe evaluated model parameters, the model appears to provide a reasonable description for thefermentation process. The antibiotics formation is gronLatch cultures withXenorhabdus nematophila YL001中国煤化工Key words: Xenorhabdus nematophila; FermeCN Gematical models