胆固醇-聚乙二醇-胰岛素偶联物的合成

2010年7月四川大学学报(自然科学版)July. 2010第47卷第4期Journal of Sichuan University (Natural Science Edition)Vol. 47 No. 4doi:103969/j. issn. 0490-6756. 2010.04. 034胆固醇-聚乙二醇胰岛素偶联物的合成杨莉'，伍晓春’，钱珊'，赵敏'，吴勇1(1.四川大学华西药学院，成都610041;.四川师范大学化学与材料科学学院，成都610066)摘要:选择了胰岛素受体为作用靶点，设计并合成了用于新型肝靶向药物传递系统的脂质体配体，以赋予脂质体的双重靶向性.以聚乙二醇2000(2)和胆固醇衍生物(3)为起始原料,经过Williamson成醚反应、酰化反应,最后与胰岛素缩合得目标化合物(1).所得目标物(1)分子量经MALDI-TOF确证.关键词:肝靶向药物;胰岛素受体;脂质体配体;合成中图分类号: R914文献标识码: A文章编号: 0490-6756(2010>04-0859-04Synthesis of cholesterol-polyglycol-insulin conjugateYANG Li', WU Xiao Chun2 ,QIAN Shan'，ZHAOMin', WU Yong'(1. School of Pharmacy, Sichuan University, Chengdu 610041, China;2. Chemistry and Material Collge, Sichuan Normal University, Chengdu 610066, China)Abstract: Insulin receptor was chosen for targeting site, a new kind of ligand for liposome in drug deliv-ery system was designed and synthesized to endue dual functions of the liposome. PEG2000 was chosenas starting material, after etherficiation by Williamson etherficiation reaction, acylation, conjugationwith insulin to obtain the target compound. The molecule weight of the ligand was confirmed by MAL-DI- TOF.Key words: hepatic targeting drug, insulin receptor, ligand of liposome, synthesis系统中主动靶向脂质体的制备,成为发展以受体介1引言导的脂质体治疗肝脏疾病的关键.脂质体在许多肝脏疾病的治疗和诊断中显示胰岛素受体是存在于肝细胞膜上的- -类特异出明显的优越性,受到了广泛的关注”1.然而传统性受体,当人肝细胞发生癌变时,其肝细胞表面的的脂质体仍然存在靶向分布不理想、稳定性较差等胰岛素受体大量增加,为正常肝细胞膜表面的532缺点,因此限制了脂质体在肝脏疾病治疗领域中的倍,所以胰岛素受体是一个将药物靶向导人到肝细应用.近年来,通过对脂质体表面进行特异性修饰，胞的一个理想靶标[3].我们在国内外首次提出制备赋予其主动靶向的特征,使其能够靶向到肝脏[2].一类肝靶向脂质体的新型配体,即胰岛素桥胆固但仍存在靶向性不够的问题,其原因在于缺乏一种醇分子(1,见图1),此类新型配体的特点是利用胆具有良好靶向性的脂质体配体.因而设计并合成这固醇PEG-胰岛素偶联物的脂溶性胆甾部分嵌人样一种新型的脂质体配体,以用于肝靶向药物传递到阳离子脂质体双层分子中,使胰岛素暴露在脂质收稿日期: 2009-07-15中国煤化工基金项目:国家自然科学基金(30672537);高等学校博士学科点专项科研基金(200506 I作者简介:杨莉(1985 -),女,四川大学华西药学院2007级硕士研究生.YHCNMH G通讯作者:吴勇. E mail: wyong@ scu. edu. cn.860四川大学学报(自然科学版)第47卷体表面,从而可识别肝癌细胞表面的胰岛素受体..将会与肝细胞膜上特异性的胰岛素受体结合,从而这种脂质体配体可用于制备主动靶向脂质体并包将药物定向在肝脏释放以增强其治疗作用,降低药裹药物，如阿霉素、顺铂等.可以设想,此类具有肝物对其他靶点毒副作用.靶向性的脂质体在包裹药物分子并进人体内之后，人ins图1化合物1的结构Fig. 1 Structure of Compound 1本文选择了以胰岛素受体为作用靶点,设计并固醇衍生物(3)[国在NaH的作用下醚化成醇(4)，合成了用于新型肝靶向药物传递系统的脂质体配随后醇(4)与丁二酸酐在吡啶中酰化得到关键中间体(1).目标化合物(1)的合成以聚乙二醇2000(2)体(5).最后,酸(5)和胰岛素缩合得目标化合物和胆固醇衍生物(3)为起始原料，其合成路线见图(1).2.首先,聚乙二醇2000(2)和我们先前已报道的胆PEG2000 +NaH,DMSO+MotahorHot~yor3|ox°po，PyrHCI COOBu' ,n-Bu.Nins!toen图2胆固醇-PEG胰岛素偶联物(1)的合成路线Fig.2 Synthetic Route of Conjugate 1里，2仪器及试剂'H-NMR用Varian INOV A(400MHz)(美国3实验方法Varian公司);IR用Perkin Elmer 983型红外仪，3.1化合 物(4)的合成KBr压片测定;质谱仪器用BIFLEX II 型MAL-将PEG2000(2)(4 g，2 mmol)充分干燥并抽DI-TOF质谱仪(BrukerDaltonics公司).电泳纯真空之后,Ar保护下,加入干燥的DMSO和THF化仪器为PROTEINI型垂直板电泳仪(BioRad各10mL,随后迅速tm人60%的每化钠,室温活化公司).实验中所用为猪胰岛素购于徐州万邦生化0.5 hr后，将治YH中国煤化工合物(3)( .股份公司,其他试剂均为分析纯，溶剂均经无水处(320 mg, 0. 5CNM.HGp,60 C反.第4期杨莉等:胆固醇-聚乙二醇-胰岛素偶联物的合成861应8 hr,冷却,将反应液倾入到50 mL冰水中,二Hz)，0.85 (d, 6 H, CH3-26 and CH3-27, J25,26 .氯甲烷100 mL分三次提取,合并提取液，无水= J25.27= 6.5 Hz), 0.66 (s, 3H, CH3-18); IRNa2SO,干燥,过滤,旋干得油状物,经硅胶快速柱(u)cm~ 1 UoH 3446, 2870, u(C=O)1750, u(C=C)层析分得黄色油状物0. 64 g,收率48%. HNMR:1647，v[CH(CH3);] 1457， u(O=C- CH2 )5.34 (m, 1 H, chol H-6), 3.74~3.60 (m, a. b. .1350，uv(C- O) 1104， 952.160 H, 80XCH2O)，3.20 (m, 1 H, chol H-3)，3.3化合物(1)的合 成2.33~0.66 (remaining chol protons) with 0. 99.将化合物(5)200 mg溶解于pH为8.6的硼(s，3H, CH3-19),0.91 (d, 3 H, CH3-21, J20.21酸 缓冲溶液中,随后依次加入氯甲酸异丁酯和三丁= 6.6 Hz), 0.85 (d, 6 H, CH3-26 and CH3-27，胺各0. 05 mL,冰浴下活化反应0.5 hr,随后加入J2,26= J25.27= 6.5 Hz)，0.66 (s，3 H, CH3-溶解于2 mL硼酸缓冲溶液的胰岛素,4 C下反应18); IR(u)cm 'v(O- H) 3445, v(C- - H) 2871, u24 hr[5]. 将反应液冷冻干燥，以SephadexG-50初(C=C) 1647， v[CH(CHz)z] 1467, u(O=C- -步纯化蛋白质,经过G-50葡聚糖凝胶柱初步纯CH2) 1352, v(O- H)1106, 952.化,除去了大部分的小分子物质.将上述凝胶层析3.2化合物(5)的合成所得的反应液用截留量为6000Da的透析袋进行将PEG2000-胆固醇(4)(0.2 g, 0. 079 mmol)透析,以0.9%的生理盐水为透析外液,待大部分与丁二酸酐(160 mg, 0. 158 mmol)混合后,抽真的盐及小分子透析完毕后,冷冻干燥,得白色粉末空,氩气(Ar)保护下,加入干燥的吡啶16 mL,加状固体.目标化合物的分子量MODLIA-TOFMS:热回流反应过夜后,旋干溶剂，残余物经硅胶快速[8423 -8610].柱层析分得黄色油状物70mg，收率在通过G-50和透析袋初步纯化的基础上,我35%. ' HNMR: 10.2 (1 H, COOH ), 5. 34 (m,们进一步尝试采用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法来1 H, chol H-6), 3.83 ~3.15 (m, a.b. 160H, 80验证是否有新化合物产生.按文献方法[6]进行电XCH2O)，3. 20 (m, 1 H, chol H-3)， 2. 33~泳,结果显示图中仅有一条电泳带的是纯的猪胰岛0.66 (remaining chol protons) with 0. 99 (s, 3H,素，显示两条带的是偶联物(见图3).CH3-19)，0. 91 (d, 3 H，CH3-21， J20.21= 6. 6图3偶联物与胰岛素的电泳图Fig. 3 Electrophoretogram of the Conjugate 1 and Insulin为缩合剂的反应条件下反应”;室温条件下在0.01.4结果与讨论mol/L盐酸溶液中反应[间;以及先将胆固醇羧酸与在合成偶合物(1)时,曾尝试用n=2~5的化HOBt在SOCl2中反应先生成活性酯,再与胰岛素合物(5)与胰岛素偶联，但未得到目标产物(经.在pH为8.4的磷酸盐缓冲溶液中偶联的方法[0]，HPLC检测,这些反应均未有除胰岛素外的新峰产但HPLC显示除猪胰岛索的峰外,未见新的峰.最生).分析原因可能是由于胰岛素为水溶性物质,缩后,我们采用在pH为8.6的硼酸缓冲溶液中反合反应必须在水中进行,而n=2~5的化合物(5)应,经HPLC检测，显示有新化合物的峰出现,经的胆甾部分所占比例大,整个化合物水溶性差,在结构鉴定确证为偶合物(1).同时MODLIA-TOF水中缩合时不反应.因此,我们采用含氧原子更多、质谱显示没有小的分子离子峰,证实胰岛索的肽键水溶性更好的PEG2000与胰岛素在水中缩合.我没有断裂.中国煤化工们对偶联反应的条件也进行了摸索,先后采用了在本文设计HCNMH G00-胰岛素4°C,pH为8.4的磷酸盐缓冲溶液,EDC/HOBt偶联物,该偶联物可用于具有双重靶向作用的肝靶.862四川大学学报(自然科学版).第47卷向脂质体的制备.该设计思想的成功,为肝靶向药terylated carboxylic acids with oligo ( polyethylene物转运系统提供了一种新型材料,为药学领域内靶glycols) units for gene delivery [J]. Lett Org Chem, .2006, 3(12): 911.向药物转运系统提供了一-种新思路.5] Takashi U, Miroslav B, Feng L, et al. Site- specific参考文献:insulin conjugates with enhanced stability and extend-ed action profile [J]. Adv Drug Deliv Rev， 1999,[1] Webb MS, LoganP, Kanter P M, et al. Bally pre-(35): 289.clinical pharmacology, toxicology and efficacy of6] 郭尧君.蛋白质电泳实验技术[M]. 北京:科学技sphingomyelin/ cholesterol liposomal vincristine for术出版社，1999.therapeutic treatment of cancer [J]. Cancer Che[7] 管昌田，钟裕国，梁正路，等.半乳糖干扰素的合成.mother Pharmacol, 1998, 42(6): 461. .及其肝靶向性研究[J].中华核医学杂志，1996， 16[2] Gijsens A, Derycke A, Missiaen L, et al. Targeting(1): 58.of the photocytotoxic compound AIPeS4 to hela cells8]刘文胜，张志荣，黄园，等.米托蒽醌胰岛素偶联物by transferrin conjugated peg liposomes [J]. Int J的制备及其性质初步研究[J].四川大学学报:医学Cancer, 2002, 101(1): 78.版，2004, 35(2): 264.[3] Kurtaran A, LiS R, Raderer M, et al. Technetium[9] Alan R K, Yuming z, Sandeep K s. Eficient con-99m- galactocyl neoglycoalyco album incombined withversion of carboxylic acids into N-acylbenzotriazolesiodine- 123 Tyr (A14) insulin visualized human hepa-[J]. Synthesis, 2003，18: 2795.tocellular carcinomas [J]. J Nucl Med，1995， 36(10): 1875.[责任编辑:李富河][4] WuXC, Wu Y, Hai L, et al. Synthesis of choles-中国煤化工MYHCNMH G.