改进的柳枝稷预处理方法及乙醇发酵研究

第30卷第12期太阳能学报Vol 30. No 12200年12月ACTA ENERGIAE SOLARIS SINICA文章编号:02540096200)12170904改进的柳枝稷预处理方法及乙醇发酵研究段仰凯,田沈,于泳,周桂雄,杨秀山(首都师范大学生命科学学院,北京100048)摘要:为了提高柳枝稷中纤维素和半纤维素糖的转化率降低水解液中抑制剂的浓度,首先,用稀酸在温和条件下对柳枝稷进行水解然后用碱对酸水解后的固体物进行预处理,接着用纤维素酶酶解并分别对稀酸水解液和酶解液进行乙醇发酵。结果表明纤维素转化率达到9426%,半纤维素转化率为60.93%,稀酸水解液乙醇发酵的乙醇产率为04416乙醇/g糖,达到最高理论值的8647%。酶解液乙醇发酵的乙醇产率为0.486g乙醇g葡萄糖,达到最高理论值的9529%。关键词:柳枝稷;温和条件;酸水解:纤维素和半纤维素转化率;乙醇;发酵;抑制剂中图分类号:TK16文献标识码:A0引言1.1.1原料柳枝稷样品由北京市农业科学院草业研究中心纤维素燃料乙醇等可再生能源的开发已引起世提供,样品含纤维素30.0%,半纤维素25.5%,其它界各国的普遍关注12。能源草是纤维素乙醇生产45.5%。粉碎,过40目筛,备用。中的重要原料草本植物柳枝稷的优势尤为突出。1.1.2纤维素酶与传统植物相比,柳枝稷的抗旱能力强、需肥量少Celluclast1L(诺维信公司),酶活为≥7000g;虫害少、产量高其作为CA植物对氮和水的利用率纤维二糖酶: Novozyme18(诺维信公司),酶活为≥高生长迅速、产量高适应性强“。若将其转化为250ug,30c0GU/mL燃料乙醇,不但可提供车用清洁能源,而且可将其资1.1.3菌种和种子液培养源化利用。故柳枝稷产乙醇的研究具有非常广阔的Pichia.stipitis CBS6054(ATCC) Saccharomyces应用前景。cerevisiae y5( CGMCC2660中国普通微生物保藏管理本研究首先在温和条件下对柳枝稷进行稀酸水服务中心)。两瓶100mL无菌的YPD液体培养基中解,将柳枝稷中的半纤维素转化为木糖,同时降低水分别接入一环CBS054和Y5,30℃,150rmin摇床振解液中的抑制剂浓度。对以木糖为主要可发酵糖的荡培养,Y5和CBS6054分别培养14h和12h,种子液稀酸水解液进行乙醇发酵然后对稀酸水解后的剩中菌体含量分别为33g/L和3g/L余固体用氢氧化钠预处理,接着将碱预处理后的固12温和条件稀酸水解体物进行酶解,最后将酶解后得到的葡萄糖进行乙将粉碎过筛后的柳枝稷混匀,每个样品按下述醇发酵。该过程既能得到高纤维素和半纤维素转化方法处理:称取2g粉碎后的柳枝稷,加入16m2%率,同时也避免了高浓度发酵抑制剂的产生,得到了稀硫酸,135℃,lmin。收集水解液并对葡萄糖、木糖高的乙醇产量。和抑制剂的浓度进行分析,然后将固体水洗至pH中1材料与方法性,50℃烘干作为碱处理样品。13NaOH预处理材料1.3.1NaOH浓度对碱处理效果的影响收稿日期:200901-19基金项目:国家高新技术发展研究(863)计划(2007AN57405:2007AA1072);北京市科委项目(Y00060000通讯作者:杨秀山(1946-),男教授博士生导师,主要从事微生物学酶和发酵工程微生物与清洁能源方面的研究。1710太阳能学报30卷取稀酸预处理后的柳枝稷,分別用1%、2%、样品中的乙醇含量。色谱条件:柱温80℃,注射室温3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%的NaOH溶液,度150℃,辅助检测器温度180℃,进样量 lule液固比10:1,60℃,48h,水洗烘干后进行酶解。滤液1.6.3抑制剂浓度测定进行葡萄糖和木糖含量分析用 Hewlett Packard5890 SeriesⅡ气相色谱仪分析1.3.2液固比对碱处理的影响样品中的抑制剂含量。色谱条件:柱温120℃,注射取稀酸预处理后的柳枝稷按1.3.1所得最佳室温度200℃,辅助检测器温度200℃,进样量lμ。NaOH溶液浓度,分别以液固比(mLg未被酸解的柳1.6.4纤维素酶活(FPU)测定枝稷)2:1、4:1、6:1、8:1、10:1、12:1在60℃浸泡48h,酶活定义:50℃保温60min的条件下,每毫升酶水洗烘干后进行酶解。对酶解液进行葡萄糖和木糖液每分钟产生 lumo的葡萄糖为一个酶活力单位。含量分析。16.5转化率计算方法1.3.3时间对碱处理的影响C=HxV×90%/(W,xR)取稀酸预处理后的柳枝稷优化的NaOH溶液式中,C—纤维素或半纤维素的转化率,%;浓度和液固比在60℃分别处理6、12、18、24、30、36、Y—葡萄糖或木糖的浓度,gmL;V——酶解液的42、48h,水洗,50℃烘干,酶解,对酶解液进行葡萄糖体积,mL;W,柳枝稷样品质量,g(本实验每个样和木糖含量分析。品质量为2g);R——纤维素(30.0%)或半纤维素1.4酶解(25.5%)的含量。取定量12小节中烘干的样品,加入20mLpH值为4.8、含0.5%6PC0*度为005mM的柠2结果与讨论檬酸缓冲溶液。酶量为每克样品加3FPU纤维素酶2.1温和条件酸解和30CBU纤维二糖酶。50℃,200r/min,48h,测葡萄酸解后水解液经高效液相和气相色谱测定,纤维糖和木糖浓度。素和半纤维素的转化率分别为2779%和6093%,乙15乙醇发酵酸和糠醛浓度分别为220g/L和137g/L5HMF(5羟1.5.1温和条件稀酸水解液乙醇发酵甲基糠醛)不可测出。由此可以看出,温和条件下大取12小节方法所得的酸解液用ca(OH)2调部分半纤维素被转化成木糖,同时水解液中的抑制剂pH至50,每个三角瓶(250mL)中加入1mL所得浓度很低,但纤维素的转化率也很低。液加入10gL酵母音和20gL蛋白胨,115℃灭菌2.2碱处理条件优化25mn接种酵母菌Y5和CBO4各10mL种子液,2.2.1NOH浓度对碱处理效果的影响30℃,80r/min,每4h取样测定糖和乙醇浓度。由图1可以看出NaOH浓度对酸解后剩余固体1.5.2酶解液乙醇发酵中纤维素的转化率有很大影响,6%NaOH处理后的用优化后的碱解条件预处理样品,酶解后取100mL酶解液加入20g/L蛋白胨和10g/L酵母肯,放入250mL三角瓶中溶解(15℃灭菌25min)。接入l0mLY5种子液,30℃,80r/min培养。16分析方法纤维素1.6.1糖浓度分析半纤维素高效液相色谱仪(High- liquid chromatographyHPLC, Waters2690)。测定样品中葡萄糖和木糖的含量。测定条件:氨柱(200×4.6mm),柱温40℃NaOH溶液浓度/%wae410示差检测器流动相:V(乙腈):v(水)=80:20,流速lmL/min,进样量20L图1NaOH溶液的浓度对碱处理的影响1.6.2乙醇测定ect of the concentration of NaoH solution用 Hewlett Packard5890seisⅡ气相色谱仪分析on alkali-pretreatment12期段仰凯等:改进的柳枝稷预处理方法及乙醇发酵研究1711固体经酶解后纤维素的转化率(66.417%)比未处理直接酶解的纤维素转化率(3356%)提高了近1倍。这是因为NaOH强的脱木质素作用6极大地促进了酶解效率。当NaOH浓度高于6%时,纤维素转化率基本不再提高,这可能是由于6%NaOH已足够去除汗维素木质素的影响,因此可将6%NaOH浓度用于下一步半纤维素实验。此外,在图中还可发现,当NaOH浓度小于2%时,固体中含有的少量半纤维素可以转化为木0糖,但当NaOH浓度大于2%时酶解得不到木糖,这时间h是由于大于2%的NaOH浓度使半纤维素破坏。图3时间对碱处理的影响2液固比对碱处理的影响Fig 3 The eifect of time on alkali-pretreatment由图2可以看出,液固比对纤维素的转化率的本实验证明,用碱浸泡可以大幅提高纤维素的转影响较大当液固比为8:1时,纤维素的转化率达到化率。这是因为木质纤维素有高度复杂的结构,这种最高,进一步增加液固比不再会提高纤维素的转化结构影响并限制了聚糖被水解成可发酵的单糖,率,这可能是由于在液固比81时,几乎所有的木质木质素被认为最重要的限制酶解的因素,而NH恰素都被溶解。另外,当液固比在(1)-(61)范围恰可以去除木质素并对纤维素起到润涨作用内时酶解液中可检测到少量的木糖,而当液固比大2.,3乙醇发酵于6:1时木糖消失。分析其原因可能是低的液固比231温和条件稀酸水解液乙醇发酵导致了低的脱木质素和低的半纤维素破坏效果,而Y5和CBS6054混合菌发酵稀酸水解液产乙醇当液固比大于6:1时,半纤维素全部被破坏并被洗结果如图4所示。葡萄糖和木糖代谢完全所用的时掉。因此液固比8:1用于下一步实验。间分别为12h和%6h。最终产生的乙醇浓度和产率分别为14.519g/L和0.441g乙醇/g葡萄糖达到了乙醇理论产率的8642%,乙醇产生速率为0.151g/Lh结果说明,温和条件下的稀酸水解液中抑制剂浓度很低并没有对混合菌的发酵产生抑制作用,并且在96h将温和条件稀酸水解液中的木糖代谢完全得到一纤维素了较高的乙醇产率。一半纤维素葡萄糖木糖乙醇液固比/mLg图2液固比对碱处理的影响Fig. 2 The effect of liquid-solid ratio on alkali-pretreatment22.3时间对碱处理的影响由图3可以看出,当浸泡时间为24h,碱处理对酶解的促进作用最大得到了最高的纤维素转化率但浸泡时间超过24h,促进作用不明显,这可能是因为随着时间h图4温和条件稀酸水解液的混合菌乙醇发酵浸泡时间的延长已被溶解的木质素发生了絮凝作用。Fig 4 The fermentation of the dilute-sulfuric acid综上所述,碱处理最优条件为NaOH6%、液固hydrolysate by co-culture比8:1、24h,处理后的固体经酶解后得到纤维素转化2.3.2酶解液乙醇发酵率为6647%,半纤维素转化率为零。加上温和条件下稀酸水解得到的糖,总的纤维素转化率为利用水解液发酵产乙醇实验结果如图5所示,94.26%半纤维素(木糖)的转化率为6093%。Y5在12h将葡萄糖全部代谢,最终的乙醇浓度和产率分别为10.282g/L和0486g乙醇/g葡萄糖达到1712太阳能学报30卷了乙醇理论产率的95.29%,乙醇产生速率为biomass: Technology, economics, the environment, and poli0.86g/L·h,表现出了较好的结果。[J]. Ann Rev Energy Environ, 1996, 21: 403-465[2] Ragauskas AJ, williams C K, Davison B H, et al. The pathforward for biofuels and biomaterials[J]. Science, 2006, 311葡萄糖(5760):484-489[3]吴斌,胡勇,马璐,等.柳枝稷的生物学研究现状及其生物能源转化前景[冂.氨基酸和生物资源[4] Porter C L. An analysis of variation between upland and low-nd switchgrass, Panicum virgatum L[J].Central Oklahoma图5酵母菌Y5对酶解液的乙醇发酵[5] Chose T K. Measurement of cellulase activities[ J]. Pure Ap-Fig. 5 The fermentation of the enzymatic hydrolysate by Y5pl Chem,1987,59(2):257-68.3结论[6 Hendriks A W M, Zeeman G. Pretreatment to enhance the综合上所述,可以得出:温和条件下的稀酸水解digestibility of lignocellulosic biomass[J]. Bioresourse Techn-液利用复合菌对水解液进行乙醇发酵,并未受到任cg,m0,00:1018柳枝稷得到了主要含木糖和低浓度抑制剂的水解7] Zhao Xuebing, Peng Feng, Cheng Keke,et al.Enhancementof the enzymatic digestibility of sugarcane bagasse by alkali-何抑制,得到了很高的乙醇产率;优化条件的碱处理peracetic acid pretreatment[ J]. Enzyme and Microbial Techn后,纤维素转化率为6647%,加上温和条件下稀酸olog,2009,44:1723水解得到的糖总的纤维素转化率为926%,半纤[8] Eriksson.,Bwm.,TmdF. Mechanism of surfactant维素(木糖)的转化率为60.93%,得到了较高的纤维effect in enzymatic hydrolysis of lignocellulose[ J].Enzyme素的转化率;碱解后固体经酶解,酶解液中的葡萄糖Microb Technol, 2002, 31: 353-64被酵母菌Y5高效转化为乙醇。本实验利用分步预9]BiA, Gilkes N,KiA,etal. Weak lignin-binding处理柳枝稷分步发酵,避免了高浓度抑制剂对发酵enzymes-a novel approach to improve activity of cellulases for影响,实现了纤维素和半纤维素的高效利用,但碱处hydrolysis of lignocellulosics[J]. Appl理过程中水洗增大了成本,这需要在以后试验中对2005,121:163-170NaOH溶液的回收和水的重复利用做进一步研究。[10] Palonen H, Tjemeld F, Zacchi G, et al. Adsorption of Tri-chodemareesei CBH I and EG I and their catalytic domains参考文献]on steam pretreated softwood and isolated lignin[J].J Bio-[1] Lynd L R. Overview and evaluation of fuel ethanol from cellulosictechnol,2004,l07:65-72MODIFIED TECHNOLOGY OF SWITCHGRASS PRETREATMENTFOR ETHANOL PRODUCTIONDuan Yangkai, Tian Shen, Yu Yong, Zhou Guixiong, Yang XiushanCapital Normal Uninersity, College of Life Scienc, Beiing 100048,ChinaAbstract: In order to effectively pretreat switchgrass, increase the conversion of cellulose and hemicellulose, reduce theinhibitory compounds concentration, switchgrass was pretreated by dilute acid hydrolysis at moderate conditions, the solidresidue was subsequently treated by alkali-pretreatment and followed by enzymatic hydrolysis. The overall conversion rateof cellulose and hemicellulose was 94. 26% and 60.93%0, respectively, dilute-acid hydrolysate can be fermented to ethanol with the yield of 0. 44lg ethanol/g sugar, and the enzymatic hydrolysate can be easily utilized to produce ethanol withethanol yield of 0. 486g ethanol/g sugar. This study provides a new way for fuel ethanol production from switchgrassKeywords: switchgrass; moderate conditions; dilute-acid hydrolysis; conversion of cellulose and hemicellulose; ethanolfermentation: inhibitor