TUNEL技术改良

中国病理生理杂志Chinese Joumal of Pahopyialogy 2001 ,17(7): 668[文章编号] 1000- 4718(2001)07 - 0668 -01TUNEL技术改良郑佩娥'，陈小琳2， 张海伟'， 黄丹|(暨南大学医学院'病理解剖教研室，2发热研究室,广东广州510632)[主题词]獼亡;方法[MeSH] Apoptoi; Methods[中图分类号] 0Q95.336[文献标识码] B细胞凋亡的研究已成为当今国内外形态学和分3 染色程序子生物学研究的新热点中。检测细胞凋亡的主要方3.1 每块蜡块作连续切片 2张,分为A、B2组A法有形态学和基因组DNA的分析。原位检测法由于组用改 良的方法EDTA. SDS处理;B组按操作手册进可在组织原位同时显示凋亡细胞的形态和分布而被行。广泛采用[2]。原位检测法主要包括:①末端脱氧核3.2操作步骤①切片按常 规脱蜡至水。②3%苷酸转移酶介导的dUIP缺口末端标记(TUNEL);②H202 阻断内源性辣根过氧化物酶10 min。③2组切DNA聚合酶1或Klenow大片段介导的原位觖口平移片分别按如下溶液处理15 min(室温):A组,0.5 mol/(INST)。我们采用Intergen公司生产的原位末端标L Tis. CI(pH7.8) 0.2 mL, 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)记试剂盒,对福尔马林固定、石蜡包埋的脑组织进行0.1 mL, 10% SDS(pH 7.2) 0.5 mL,用去离子水加至TUNEL染色,在操作手册和已有文献的基础上进行10mL;B组,蛋白酶K20mg/L,以下一切步骤相同。方法改进,旨在比较酶消化法与EDTA和SDS消化法④PBS漂洗3次,各2 min。⑤平衡缓冲液室温10的优劣,提供研究细胞凋亡的新技术。min,轻轻擦去多余液体。⑥加TUNEL反应液37C温材料和方法育1h。⑦阻断液室温10 min。 ⑧PBS洗3次,各2min。⑨加过氧化物酶标记的抗地高辛抗体室温301标本处理鼠脑冻伤组织,常规10%福尔马林固定,石蜡包min。◎PBS洗3次,各2min。①DAB显色5-10min。②阴性对照片为省去TUNEL反应液。埋,5 pm切片。2试剂准备结果Intergen公司生产的原位末端标记试剂盒;0.51 A 组阳性细胞的核呈棕色着染,核固缩,染色质mol/L EDTA( pH 8.0);10% SDS( pH 7.2); 0.5 mol/聚生成致密的团协或地色质沿核膜凝集而呈新月L Tris.Cl( pH7.8);蛋白酶K:20 mg/L,用0.01 mol/中国煤化工~膜包绕的凋亡小体LPBS配制;DAB- -H202 显色液:DAB用0.1 mol/LTris. Cl(pH 7.6)配成0.4% ,分装- 20C避光保存,用.H2 B组组织中,阳性反应区域累及全部细胞,含澗CNMHG前稀释10 倍,并加人H202,终浓度为0.001%。亡及非凋亡者,呈现极为强烈的非特异性染色(图2,见加页I )。[收稿日期] 2001-03-26[修回日期] 2001-04-29(下转第686页)(上接第668页)方法稳定、简便、重复性强，特别适应于福尔马林固定,石腊包埋的某些难处理的组织。讨论[参考文献]TUNEL染色的结果常常受诸多因素的影响,如.细胞的坏死，固定剂的类型,预处理的方法等。在实[1] 苏长青.细胞凋亡的基因调控及应用展望[J].临床与验过程中,我们感到蛋白酶K的浓度,作用时间的长实验病理学杂志, 1997, 13(i):137- 143.短均是影响TUNEL染色成败的关键,也是较难掌握[2] Wijsman JH, Jonker R, Keijzer R, et al. A new method to的一环。有研究表明,蛋白酶K的作用有可能引起delect apoptosis in parafn sctions: in siu end - labeling offragmented DNA[J]. J Histochem Cytochen, 1993 ,41(6):7内源性核酸内切酶的释放，造成假阳性反应3]。所以消化时间长,非特异染色增多,使一些正常细胞也中国煤化工，et al, False positive staining着染,而消化时间太短,细胞膜达不到应有的通透性,影响标记效果。后来我们省去蛋白酶K这一步，YHC N M H Gof endogenous Dhaee and im-hibited by diethyl - pyrocarbornate ( DEPC) in liver tsse[J].改用EDTA, SDS缓冲液预处理,获得满意结果。该Hepatology, 1996, 4(3):268 - 273.