PCR技术简介

《西藏科技》2005年11期(总第151期)信息技术PCR技术简介何燕旦巴卓嘎孟霞(西藏大学农牧学院农学系,西藏林芝860000)摘要:现代生物技术在近20年的发展中受到了各方人士的普遍关注,更有许多专家将21世纪称为生命科学的世纪,将现代生物技术产业称为21世纪的朝阳产业。而PCR技术是现代分子生物学和生物丁程技术的灵魂,PCR技术已经成为遗传与分子分析的根本性基石。PCR技术操作简便,结果可靠,被世界各国广泛应用于医学、农业、考古学,甚至是刑侦方面。本文简要介绍了PGR技术的原理、反应组分及应用中常见问题。在农业方面,PCR技术作为分子植物育种实验室的技术平台具有较好的实用性。在西藏自治区,分子植物育种方法尚未起步。本文旨在向大家简单介绍PCR技术,以期一问探讨在西藏这个种质资源丰富地区的常规分子生物学及生物丁程技术的应用。关键词:PCR技术中图分类号:Q5241前言右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的PCR,即聚合酶链式反应(PolymeraseChainReac-双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为tion,PCR)是1985 年由美国PE- Cetus公司的科学家下轮反应做准备;K.B.Mulis发明的一项可在体外快速扩增特定基因或1.2 模板DNA与引物的退火(复性) 模板DNA经加DNA序列的新技术。它借助PCR仪,根据生物体内热变性成单链后,温度降至55C左右,引物与模板DNA序列能进行快速复制的某些特点,实现在体外对DNA单链的互补序列配对结合;特定DNA序列进行快速扩增,可在短时间内在试管中1.3 引物的延伸DNA模板- -引物结合物在TaqDNA获得数目万个特异DNA序列拷贝。该系统自问世以聚合酶或其它DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应来获得广泛应用,同时也成为获得外源基因的-一个有原料,靶序列为模板,按碱基互补配对与半保留复制原效手段。发明人Kary Banks Mulis因此而荣获1993年理,合成一.条新的与模板DNA链互补的半保留复制度诺贝尔化学奖。PCR 技术神奇在于:一是被扩增的链。重复循环变性一褪火-延伸三过程,就可获得更DNA所需量极小,理论上讲-一个分 子就可以用于扩增多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循了;二是扩增效率高,几个小时就可将靶序列扩增环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时100万倍以上。就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。程,DNA聚合酶以一段单链DNA为模板,借助一小段2PCR仪双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡目前的PCR仪已经可以设定程序，研究者可以根核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合,据不同的实验要求进行许多类型的机器选择。这些形成部分双链。在适宜的温度和环境下,在体外通过PCR仪的选择可体掘研空去巫好、经费以及仪器和酶促反应以百万倍扩增一段目的基因。其特异性依赖使用中国煤化工要注重其稳定性及经于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性一久耐YH. CNMHG择上。退火一延伸三个基本反应步骤构成:3 PCR 反应基本成分1.1 模板DNA的变性模板DNA经加热至93C左3.1模板DNAi3信息技术《西藏科技》2005年11期(总第151期)PCR反应的模板可以是单链或双链DNA,可以是.配率上升,降低合成速度,并导致反应过早终止。一般基因组DNA、重组质粒或λ噬菌体,或者任何其它含有实验室常用的dNTP's直接从专业公司购买。DNA的生物样品,mRNA也可作为PCR的模板,只需3.4热稳定 DNA聚合酶用逆转录酶把mPNA逆转录为cDNA即可。由于PCR最初的DNA聚合酶中从人肠杆菌中提取的,对热反应的特异性由寡聚核苷酸引物决定,因此模板DNA敏感,DNA变性温度可使其火活,因此在PCR的变性不需要高度纯化,但应避免任何蛋白酶、核酸酶、DNA步骤后必须重新加入DNA聚合酶,造成操作技术烦聚合酶抑制剂、能结合DNA的蛋白质及多糖类物质的琐、耗时、费力、成本加大,且效率低。在热稳定DNA污染。选用纯化的DNA做模板,可增加模板分子的浓聚合酶尚未发现之前,PCR可能还是-种笨拙的中看度,提高PCR扩增的有效性。不中用的实验室方法。PCR所需的模板DNA的量极微小，通常在纳克.1988年Saiki等从美国黄石国家公园的温泉中分级,适宜的模板DNA浓度为30 ~ 50ng,不到1ng的基离的一-株水生嗜热杆(Thermus aquaticus, Taq)中提取到因组DNA序列就足够用来进行PCR分析,甚至有1个一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点:①耐高DNA分子就可以扩增出特定的NDA序列。温,在70C下反应2h后其残留活性大于原来的90%，3.2 引物在93C下反应2h后其残留活性是原来的60%,在.PCR反应成功的关键是设计最适合的引物。引物959C下反应2h后其残留活性是原来的40% ;②在热变设计的先决条件是与引物结合的靶DNA序列必须是性时不会被钝化,不必在每次扩增反应后再加新酶;③已知的,与两个引物结合的序列之间的靶DNA序列则大大提高了扩增片段特异性和扩增效率,增加了扩增未必清楚。PCR 引物是-段与待扩增的目标DNA序长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率,因而列侧翼片段互补的寡核苷酸片段,长度大多为10~ 30其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow个碱基。通常,一对引物包含5'端与正义链互补的寡片段区别,将此酶命名为TaqDNA多聚酶(TaqDNA核苷酸片段和3'端与反义链互补的寡核苷酸片段,这Polymerase)。 此酶的发现使PCR广泛的被应用。两个寡核苷酸片段在模板DNA.上的结合位置之间的由于Taq DNA多聚酶没有3'→5'外切核酸酶活距离决定PCR扩增片段的长度。引物过长往往会降性,缺乏校止错配核苷酸的能力,通常错配率为2x低其与模板的杂交效率,从而减低PCR的反应效率。10-*。为了减少错配率,可增加模板分子或减少循环用于PCR反应的每条引物的K度通常为20~30.次数利减低DNA合成的总量,或者使用高保真酶Pfu个核苷酸,包含几乎相同数量的四种碱基。由于引物DNA聚合酶。Pfu DNA聚合酶是- -种具有高保真性能设计涉及的因素较多,因此常借助PCR引物设计软件的高温DNA聚合酶,来源于高温嗜热菌Pyrococcusfu-如:PCGENE、DNAMan进行辅助设计,然后由专业的生riosis。 Pfu DNA聚合酶的热稳定性比Taq酶高,因此，物技术公司用DNA合成仪合成。在PCR反应中,引物目前Pfu酶被公认为是取代Taq酶的首选高保真高温的适宜浓度为0.1 ~ 1mol/L。引物浓度过高,容易形成DNA聚合酶。除此之外,还有一些常见的Pfu DNA聚非特异性扩增;引物浓度过低,则不足以完成30个循合酶:Tth DNA聚合酶;Tl DNA聚合酶:Ti DNA聚合环。在分子植物育种的实验室中一些通用的引物，可酶:PlatiumnDNA聚合酶等也都具有较好的耐热性和高向专业的生化与分子生物学试剂公司购买。保真性。目前西藏大学农牧学院西藏高原分子育种实3.3 dNTPs验室用的是Taq酶。dNTPs包括dATP, dCTP, dGTP, dTTP,是PCR反应3.5缓冲液中靶DNA序列扩增的原料。在PCR反应中,每种脱氧PCR反应的标准缓冲液通常含有10mmol/LTris -核苷三磷酸的浓度以50 ~ 200mmol/L为宜。浓度过高HCl(中国煤化工.5mmo/LMgCl。这种.容易引起非特异性PCR产物,当dNTP 浓度高于标准YHCNMHG体系的PH值会下降150mmol/L会抑制Taq酶的活性;而浓度过低,(如低于个多单位,使缓冲液的PH值7.2,基本适用于各种模10~ 15mmol/L时)又会影响扩增的产量。而且4种板及寡核苷酸引物。一般购买的10x PCR缓冲液成dNTP的摩尔浓度应相同,不平衡的浓度会导致碱基错分有含Mg*和不含MgZ* 两种,具体使用哪种可由实54《西藏科技》2005年11期(总第151期)信息技术验室人员根据需要及经验而定。变性后的两条模板相配对。3.6 Mg+4.3引物 延伸温度和时间Taq DNA多聚酶作用时需要Mg* ,每次扩增反应引物延伸是DNA聚合酶将脱氧单核苷酸逐一地时必须确定最佳Mg+浓度。PCR反应体系中Mg2*的加到引物3’- 0H末端,依据模板序列合成-条互补浓度十分重要。一般Mg+浓度以高于dNTP总浓度新链的过程。引物延伸温度取决于DNA聚合酶的最0.5~2.5mmol/L为适宜。Mg*+ 浓度过高,容易生成非适温度。延伸时间取决于靶序列的长度、浓度和延伸特异性扩增产物;但如果MgZ* 浓度过低,又会使PCR温度,一般为1~ 3min。靶序列越长、浓度越低、延伸产量降低。温度越低,则所需要的延伸时间越长,反之则反。3.7矿物油该过程即将反应体系温度调整到DNA聚合酶作如果PCR仪没有配置加热盖,为了防止PCR反应用的最适温度,然后以目的基因为模板,合成新的过程中反应液体的蒸发,还需要在反应液体上面加约DNA链。50μl矿物油或液体石蜡覆盖,以维持反应体系的浓度4.4循环次数和热恒定性,以保证PCR反应的有效性升增加扩增产DNA双链变性、退火、延伸这三个步骤反复循环量。石蜡油不仅有防止液体蒸发的作用，还有使PCR的次数通常需要25 ~ 40次。适官的循环次数主要是反应体系内各组分(如引物与模板)在反应液加热变性取决于靶DNA序列的起始浓度。基于PCR的实验方前的阻隔效应。这种阻隔对防止PCR反应的开始阶法很多,其手忙脚乱的反应体系和反应程序也各有异段引物的非特异性结合具有重要作用。同,应视具体情况而定。一般,循环次数过多时,产物4 PCR 反应程序参数会相应增多,但是非特异性产物的量也会增加,而且非PCR反应程序参数即循环参数是指PCR循环中特异性产物的复杂度也会增加;循环次数过少,则会降每一反应步骤的温度、时间和循环次数。参数的正确低PCR的产量。与否是PCR反应成功与否的保证。适宜循环次数可参照下表: .4.1 变性温度和时间不同靶DNA分子数所需的适宜循环次数变性的目的是要使双链DNA完全解链成单链，既靶分子数循环次数要保证变性充分,使双链DNA完全解链,又要保持3x 10DNA聚合酶在整个反应过程中的活性。因此原则上5x l030~ 35变性步骤要在高温和较短的时间内进行。如果变性不1x 10'35~40540~45充分,DNA双链会很快恢复,导致PCR产物产量明显减少;反之,如果变性时温度过高,时间过长的话,会加假设扩增效率为“X" ,循环次数为“n”,则二者与.快酶的失活。- .般变性的条件是9SC,时间为30秒扩增倍数“y”的关系式可表示为:y=(1+X)"。扩增30钟。解链温度(Tm)值可以根据靶DNA链中的(G+个循环即n= 30时,若X= 100%，则y=2°=C),按公式Tm=81.5- 16.61g[Na* ]+0.41(G+ C)% .1073741824(> 10)。 而若X= 80%时,y= 1.80=- 660/N来计算,其中N为链长。模板DNA或PCR产45517159.6(> 10’)。由此可见,其扩增的倍数是巨大物的变性不完全,是PCR反应失败的常见原因。的。4.2退火温度和时间5 PCR 应用中的污染及对策退火的作用是使模板DNA的单链与引物相结合。PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高退火温度是引物与模板特异性结合的最佳温度设定，的灵敏性,但在PCR中普遍遇到的问题是可被寡核苷引物退火温度和时间取决于引物的长度、碱基组成和酸引物中国煤化工染问题。在反应成分中的浓度。退火温度和时间是任何一个5.1MYHCNMHG染是由于研究者操PCR反应体系中最重要的参数。通常退火温度比引物作不干净引起的。的解链温度低5C,-般实验采用37~55C或稍高一5.1.1来自实验材料污染。如重组克隆的DNA、或者些,时间为1分钟。该过程即能使- -对引物能分别与|来自同一次 PCR的扩增产物污染。主要是由于在5:信息技术《西藏科技》2005年11期(总第151期)PCR试剂配制过程中，由于加样枪.容器双蒸水及其要十分小心,吸样要慢,吸样时尽量一次性完成,忌多它溶液被PCR核酸模板污染。次抽吸,以免交叉污染或产生气溶胶污染。5.1.2来自其他测试样品污染。 标本污染主要有收5.2.3预混和分装 PCR试剂。所有的PCR试剂都应集标本的容器被污染,或标本放置时,由于密封不严溢小量分装,如有可能,PCR反应液应预先配制好,然后于容器外,或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;小量分装，~ 20%保存。以减少重复加样次数,避免污标本核酸模板在提取过程中,由于吸样枪污染导致标染机会。另外，PCR试剂，PCR反应液应与样品及PCR本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或产物分开保存,不应放于同- -冰盒或同- -冰箱。形成气溶胶而扩散,导致彼此间的污染。5.2.4 防止操作人员污染，使用一次性手套吸头、小5.1.3 “遗留”污染。这是PCR反应中最主要最常见离心管应一次性使用。的污染问题。因为PCR产物拷贝量大(一般为1013拷5.2.5选择质量好 的Eppendorf管。以避免样本外溢贝/ml),远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极及外来核酸的进入,在打开含有PCR所用试剂的微量微量的PCR产物污染,就可造成假阳性。离心管前,先把离心管放置在超净工作台的离心机中5.1.4还有一种容易忽视,最可能造成PCR产物污染进行短暂离心(10s)。这可以使液体沉在底部并减少的形式是气溶胶污染。在空气与液体面摩擦时就可形手套和移液装置污染的可能性。开管动作要轻,以防成气溶胶,在操作时比较剧烈地摇动反应管,开盖时、管内液体溅出。吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污5.2.6减少PCR循环次数。只要PCR产物达到检测染。水平就适可而止。.5.1.5实验室中克隆质粒的污染。在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室,这个问DNA污染源的去除可通过用254nm的紫外线特题也比较常见。因为克隆质粒在单位容积内含量相当定的试剂(去除dNTP和H0的缓冲液)来实现。紫外高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在线照射也可用于小的装备如:支架、移液器等的外表面活细胞内的质粒,由于活细胞的生长繁殖的简便性及去除污染。工作区、微量离心管的非金属表面和PCR具有很强的生命力,其污染可能性也很人。仪可用弱漂白粉溶液去污染。5.2防止污染的方法随着现代分子生物学的迅速发展,科学技术的不5.2.1合理分隔实验室。 在理想的条件下, PCR应该断进步,新型PCR仪器及相应试剂、试剂盒、新的凝胶在一间单独的实验室内进行操作,但是对于大多数的电泳设备的不断出现，PCR技术的实验方法也变得越研究者来说,较为实际的选择是在实验室中为设置来越简便、快捷、实用,也向着更加智能化的方向发展。PCR划出特定的区域:将样品的处理、配制PCR反应操纵遗传物质来满足生命体的特殊要求,将会给人类液.PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分的现代生活带来根本性的重大变化。室进行,特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其参考文献它步骤严格分开。最好能划分①标本处理区;②PCR[1] 分子克隆实验指南(第三版)(美)J.萨姆布鲁反应液制备区;③PCR循环扩增区;④PCR产物鉴定克,D.W.拉塞尔著,黄培堂等译,科学出版社区。其实验用品及吸样枪应专用。实验前应将实验室[2]现代生物技术导论,瞿礼嘉、顾红雅、胡苹、 陈章用紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA。良著.高等教育出版社、施普林格出版社.5.2.2吸样枪。 吸样枪污染是一个值得注意的问题。本文中有些资料摘自Intenet 网站,资料中未列出由于操作时不慎将样品或模板核酸吸人枪内或粘上枪作者，在此向作者表示感谢!头是一个严重的污染源,因而加样或吸取模板核酸时中国煤化工编校陈莎莎MHCNMHG56.