合成乙醇重组乳杆菌的研究

934微生物学通报200年34(5)合成乙醇重组乳杆菌的研究夏子芳王正祥”(工业生物技术教育部重点实验室和江南大学生物工程学院无锡214122)摘要:将含有2 monona mobi乙醇合成途径的关键酶基因的片段 Ptac-pde和 PtacadhB,分别/同时接入pHY3O0PLK以及 pBBRIMCS5载体中,得到了 pHY-PA、 PBBR-PA等重组质粒,分别转化入几株乳杆菌。在42℃下进行乙醇发酵试验,结果表明:在 Lactobacillus plantarum CICIM B00中同时引入基因pdk、adhB有效地将碳代谢流导向了产乙醇方向重组菌Bo080(pHY-PA)发酵67%葡萄糖60h分别产生0.4%(VV)乙醇,为原始菌B000的67倍;而将pd、aihB基因同时引入L. amylotonu B0112和L, acidophilus B00,能检测到相当于原始菌2倍的乙醇产出。在重组菌发酵过程中,仍有大量的乳酸产出,在引人产乙醇基因的同时敲除乳酸脱氢酶基因,将有可能使乳杆菌的代谢流向更有效地转向产乙醇途径。关键词:乳杆菌,乙醇, Ptac-pdc,Pc~adhB中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:0253-2654(200705093405Recombinant Lactobacilli for Ethanol ProductionXIA Zi-FWANG Zheng.Key Laboratory of.Ministry of Education and School of Biotechnoogy, Wuri 214122Abstract: Recombinant plasmids pHY-PA, PBBR-PA were constructed in which genes pde and adhB were placed under the control o Lac promoter,respectively, and had successfully expresed in Escherichia coli. Then these recombinant plasmids were electroporated into lactobacill strains forethanol production. Preliminary ethanol fermentation using these Lactobacillus strains and their recombinants was carried out using 42C asfermentation temperature. The results indicated that introducing pdc and adhB, athanologenic pathway was succesfully constructed in L plantarumICIM B0080. 0.4%(v/V)ethanol wes detected at the end of fermentation with 6.7% glucofold of cthanol production was detected in L. amylowanus B0112(pHY-PA)and L, acidophil B0068(pBBR-PA). Introducing bothadh B, and meanwhile knock-outing the lactate dehydrogmase gene may better convert carbon flux to ethanologenic directionKey words: Lactobacilus, Ethanol, Pgac pde, Ptac-adh B乳杆菌是一类革兰氏阳性兼性厌氧菌,适宜生产条件。因此,对乳杆菌的代谢途径进行改造,有长温度髙达40℃~50℃,能在较低的pH和较高盐望获得新型乙醇发酵菌株。另一方面,乳杆菌作为浓度的环境下生长;其中大多数能够代谢包括五碳发酵乳制品的主要生产菌种适量乙醇的产出有利糖和六碳糖在内的多种糖类;能产生具有抑菌或杀于食品风味的改善能与酸类物质形成特有的香菌作用的细菌素,在发酵生产中能起到抑制其他细味给人以提神刺激的感受3;发酵乳制品中的微量菌的作用。同时,乳杆菌是目前基于酵母菌的乙醇乙醇能促进消化腺机能增强刺激肠胃蠕动,促进发酵中的主要污染菌2,与酵母竞争性利用培养有机体的代谢”基中的碳源和各种营养成份,其代谢产物能影响酵乳杆菌中,代谢产生的大量丙酮酸经乳酸脱氢母的生长,以致酒精产量的降低;但这也从另一个酶(LDH;111.27)催化而转化为乳酸,通过强化细侧面反映出乳杆菌能够适应乙醇发酵过程中的生胞内的丙酮酸脱羧酶(PDC;EC4111)和乙醇脱新世纪优秀人才支持计划(No.NCET04904)TYH中国煤化工扩增目标途径,是CNMHG通讯作者Emi:mwag@syt.dm,cn收稿日期:200701-19,修回日期:200704022007年34(5)微生物学通报935构建产乙醇乳杆菌的主要策略。本研究以已实现植物乳杆菌( Lactobacillus plantarum)ccM在E.co中表达的重组质粒 pEtac-PA°为基础构B00、噬淀粉乳杆菌(L. amyloworus)B012、嗜酸乳建了 pHY-PA, PBBR-PA系列质粒。在此基础上构建杆菌(L. acidophilus)B0068,克隆宿主茵大肠杆菌乳杆菌重组菌探索重组乳杆菌的乙醇合成能力。( Escherichia coli)JM109,由江南大学中国高校工业1材料和方法微生物资源和信息中心( CICIM-CU,htp:/ cicim-custu. edu,cn)保藏。本研究中所使用及构建的菌株1.1菌株和质粒和质粒见表1。麦1菌株和质粒Strain or plasmidCharacteristies and descriptionSource or referenceStrainsLactobacill plantarum B0080wild-type strainLsolated from pickle fermentation facilityL. amylovora B01 12Wild-type strain, capable of raw starch degrading[7]wild-type strain,kowph toleranceEscherichia coli JM109CICIM-CUEtac-PAKanr: harboring pde and adh B that were placed under the control d [6]Amp, Tet: E. aodi- Bacillu sp, shuttle vectorCICIM-CUAmp, Tet': harboring Ptac-ad BAmp, Tetr: harboring both Ptacpde and PRac-adhBpBBRIMCS-SGm; board-boet-range veetorCHCIM-CUpBBR-PAGm: harboring both Ptac- pde and Ptac-adhBThis work12培养基和培养条件14DNA操作技术乳杆菌的培养采用MRS培养基(每升含有10gDNA片段胶回收、产物纯化用华舜试剂盒进牛肉膏,10g蛋白胨,5g酵母抽提物,20g葡萄糖,1g行。质粒DNA的提取酶切连接转化等参照文献吐温80,2gK2HPO3,5g乙酸钠,2g柠檬酸二铵,0.2g[8进行。MgO4·7H10,0.05 g EnSO4HO,pH6,2~6,5)。在1.5转化方法42℃静置培养24h~48h。含13%琼脂的固体MRS乳杆菌的电转化按照文献[9]进行。大肠杆菌培养基(含相应抗生素)用于转化子的筛选和计数。的转化按照文献[8]进行。大肠杆菌的培养使用LB培养基(每升含有10g胰1.6酶活测定蛋白胨、5g酵母浸提物、10 g NaCI),37℃下培养。含重组子用MRS培养基培养过夜,离心收集菌1.3%琼脂的培养基(含相应抗生素)用于转化子的体以磷酸盐缓冲液(pH6.5)洗涤悬浮,超声波破筛选。壁。酶活测定参照文献[6]进行。13薛与试剂1.7发酵试牛小肠碱性磷酸酶(CLAP)、T4DNA连接酶、各以含有67%葡萄糖的MRs培养基为发酵培养种限制性内切酶和蛋白质分子量标准均为晶美生基250mL三角瓶中装液量为50mL,每瓶加入2g物工程有限公司产品;胶回收试剂盒为上海华瞬生CaC03中国煤化工夜中葡萄糖和乳物技术有限公司产品。其他试剂药品为国产或进酸含CNMHG农度采用气相色口的分析纯和生化试剂。谱法测定,色谱参数为:汽化室温度200℃,检测器936微生物学通报2007年34(5)(HID)温度260℃,传输线温度130℃。载气N2压力上,构建pHY-pdc、pHY-adh、 pHY-PA,和pBR-PA。5ka,流量2ml/mn;助燃气空气流量400mL/mn;首先以BamH和Sa酶切质粒 pEtac-PA,同时回收燃气H2流量47mL/min。顶空瓶平衡温度:70℃,平 Ptac-pda(约23kb)和 Ptac-adh B(约16kb)片段。将衡时间:30min。前者插入 pHY300PLK的BamH位点,得到pHY-pd;将后者插人以BamH和 salI酶切的2结果pHY3K载体,得到 pHY-adh;再将 Ptac-pdc片2.1重组质粒的构建段插入pHY-adh的BamH位点,得到 PHY-PA(图在本实验室先期构建的质粒 pEtac-PA的基础)采用相似方法构建获得重组质粒pBPABamH IBamH IBamH IPiac-adhAPr PHY300PLKpHYadh6.4 kbBamH IY-PA图!重组质粒pHY-pd、 pHY-adh、 PHY-PA的构建过程22重组乳杆菌PDC、ADH酶活测定2.3重组菌的初步酒精发酵对重组菌中的PDC和ADH酶活进行了测定挑取各重组菌及原始菌单菌落接种于10mL含(表2)。酶活测定的结果表明,pdk、adhB基因在有相应抗生素的MS培养基中,42℃静置培养过夜L. plantarum E0080中成功实现表达。对后将其作为种子液以1%(VV)接种到50mL含约L. acidophilus B008、L. amylowonus Be011及其相应67%葡萄糖的MRS培养基,其中加入了2 g caco3,重组菌进行PDC和ADH酶活测定结果同样表明:4℃n中国煤化工60h:L. plantarum重组菌的PDC和ADH酶活均相对于其原始菌株有BCNMHG约0.6%(vv)所提高(表2),ph、ahB基因在这两株乳杆菌中同的乙浮;重组图boo(pHY-ah)Bxp( pHY-PA)分样实现了表达。别产生033%0.4%(VV)乙醇(图2)。2007年34(5)微生物学通报囊2重组菌中PDC和ADH酶活Specific activitie(U/mgBOOS0 B008D(pHYpde)B0080(pHlY-adh) BO080(pHY-PA) B0068 B0068(pBBR-PA) B0112 B0112(pHY-PA)0.15820.2730ADH0.32300.34602.73023.31630.09880.5018图2 lactobacillus plantarum及重组菌的酒精发酵根据酶活测定和乙醇发酵试验结果各重组菌3讨论的PDC的酶活为原始菌的13~19倍,重组菌的乙乳杆菌能代谢多种糖类,能在较为严峻的环境醇产量和ADH酶活成正相关:B0080(pHY-pdk)和条件下生长,是发酵产乙醇的合适改造候选菌。但原始菌相近,只能产生约0.006%(V/V)的微量乙在乳杆菌中,代谢产生的大量丙酮酸都经乳酸脱氢醇;在B00(pHY-ah)、B080( pHY-PA)中能检测酶(LDH;11.127)的催化而转化为乳酸仅有极少到约为原始菌10倍的ADH酶活,同时两重组菌发量的乙醇经异型乳酸发酵产生。将“产乙醇基因”酵6.7%葡萄糖60h分别产生0.33%、0.4%(ⅥV)引入乳杆菌是构建产乙醇的乳杆菌的主要策略。乙醇(图2);且BO080( pHY-PA)的乙醇产量比本研究中三菌株的最适生长温度约为42℃,适B∞080( pHY-adh)略高,说明在L. plantarum B0080于目前发酵工厂中普遍使用的发酵培养温度,同中同时引入基因pde、ahB最有效地将碳代谢流导时较高的发酵温度有利于乙醇的收集亦可防止染向了产乙醇方向。菌;且三菌株各具特点,具有重要的工业应用价值x数如生0wma门H中国煤化江题发重组菌BO8( pBBR-PA)、B0( pHY-PA)分别合了在该菌株中分别引人pd基因和/或ahB基因成12×103、1.0×10-3(VV)的乙醇。时,重组菌的乙醇发酵情况。酶活测定和乙醇发酵微生物学通报00年34(5试验结果说明:在L, plantarum B0080中同时引人方面,若利用本研究所构建的重组乳杆菌进行乳制基因pde、adhB最有效地将碳代谢流导向了产乙醇品单一菌种发酵,产生的乙醇有利于改善乳品的口方向。菌株L. amylovora B11于1981年由感,不至于掩盖乳酸菌发酵的风味,又能刺激肠胃Nakamura报道,能够利用多种碳源且具有生淀粉蠕动,促进新陈代谢。降解能力;菌株L. acidophilus BO68能够适应酸性参考文献的培养环境,其最适生长pH为45,自身代谢产生的乳酸不易抑制菌体生长,且较低的pH环境有利1] Narendranath n v,HwsH, Thomas k c,aal, Appl Environ于该菌株的纯培养不易染其他杂菌。将pde基因和uhB基因同时引人上述两菌株:检测到的乙醇为2 I Kelly AS,TmDL., J Ind Microbiol Biotech,0,.32:401原始菌的2倍。我们还考察了重组菌L. amylotorus[3]杨具田草与畜,19%,1:37-39B0( pHY-PA)直接利用4%玉米淀粉合成乙醇的[4]刘振民,骆承庳,食品工业,20,1:21-23情况:发酵终了能检测到0.083%(VV)的乙醇产[S]李华,丘文,周广祥.中国奶牛,00,1:3-5出,而原始菌B0112仅产生0.6×103(WV)乙醇。[6】孙金风,徐敏,张峰,等.撒生物学报,2004,4(5):600本研究还发现,重组菌的丙酮酸代谢主要还是[7] Nakamura L K. Int J Syst Bacteriol,1981,31:56-63流向产乳酸途径我们正进一步设计,在引入pd和[8]Sambrook J, Fritscb E, Maniatis T. Molecular Cloning: a LaboratoryadhB基因的同时,利用同源重组敲除乳酸脱氢酶Manual, 2 Ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Prese基因,打断乳杆菌中由丙酮酸代谢产生乳酸这一主流代谢途径,以期获得乙醇高产重组乳杆菌。另一[9] Tompson K, Collins ma. J Microbiol Methode,9,26:73-7新书推介科学出版社生命科学编辑部新书推介精编蛋白质科学实验指南( Short protocols in Protein science)[美]J.E.科里根等编李慎涛等译978703-0180860定价:120.002006年12月出版本书是《最新蛋白质科学实验指南》( Current Protocols in Protein Science;CPPS)一书的精编版本,内容全部取材于该书和每季度更新的服务手册,其详细提供了多种实验方案,并包含实验材料、步骤和每种技术的参考文献等信息,可使有经验的研究人员将其作为独立的实验室指南来使用。由于蛋白质具有多样性,其分析也必须包括很广范围的结构和理化方法,因此每个研究人员都必须尽可能多的同时掌握最新方法和传统方法。本指南中既包括特定的详细方案,也包括使方法适应手头特定项目的策略能够帮助读者进一步深人进行蛋白质科学和相关领域的研究。欢迎各界人士邮购科学出版社各类图书(免邮费)邮购地址:100717北京东黄城根北街16号計科学分計联系人:阮芯联系电话:0106中国煤化工更多精彩图书请登陆网站htp:!/w. lifesCNMHG