胸腺五肽及其聚乙二醇衍生物的固相合成

承德医学院学报JOURNAL OF CHENGDE MEDICAL COLLEGEVol.28 No.4 2011基础医学胸腺五肽及其聚乙二醇衍生物的固相合成韩月,王良友,尹志峰,高 杨,赵红玲,吕逄春.(承德医学院中药研究所,河北承德067000)[摘要]目的Fomc法固相优化合成胸腺五肽(TP5)并对其进行聚乙二醇(PEG)修饰,以延长TP5在体内的半衰期。方法:采用固相合成技术合成PEG化TP5,高效液相色谱进行分析和纯化,氨基酸测序仪测序。结果:经鉴定,合成的TP5和PEG化TP5与理论值--致。结论:该方法操作简单、成本低,得到的产品纯度较高、易于纯化。[关键词]胸腺五肽;聚乙二醇化;固相合成[中图分类号]Q78[文献标识码]A[文章编号]1004- -6879<2011)04- 0351-03SOLID PHASE SYNTHESIS OFTHYMOPENTIN PENTAPEPTIDE AND PEGYLATEDTHYMOPETIDUMHAN Yue, WANG Liang you, YIN Zhi-feng, etal(Institute of Chinese Mateia Medica, Chengde Meidical College, Hebei Chengde 067000, China)[ABSTRACT] Objetive: Io optimize the solid phase synthesis method of thymopentin pentapeptide (TP5) andsynthesize pegylated TPS, so lengthen the half life period ofTP5.Methods:Solid phase synthesis was used to synthesizeTP5, high performance liquid chromatography to analyze and purify, protein sequencer to detect the sequence of aminoacid.Results:The TP5 and pegylation TPS was in conformity with theoretical value.Conclusions: This craft is convenientand low cost, the purity of products is fairly high and the product is easy to be purified.[KEY WORDS] Thymopentin pentapeptide; Pegylation; Solid phase synthesis胸腺五肽(thymopoentin pentapeptide,TPS) 的氨基时以原型分子自肾脏排出,高于30000Da自粪便排泄。为酸序列为H-Ang -L.ys -Asp-Val-Tyr OH,是- -种免疫避免在修饰过程中发生交联和团聚,通常采用甲氧基聚调节剂,具有促进胸腺细胞和外周T细胞、B细胞的分化乙二醇(mPEG)作为修饰剂的合成原料,其化学通式为和发育,调节机体免疫功能等生物活性"。临床上TP5主CHzO(CH2CH2O)nCH2CH20H。多肽和蛋白质经PEG要用于原发性和继发性免疫缺陷症及各种恶性肿瘤前期修饰后不仅能较好地保留生物活性,还可增加稳定性、延及化疔、放疔的辅助用药,也是最有疗效的治疗慢性乙型长体内半衰期。本研究在合成IP5的基础上对其进行PEG肝炎和艾滋病的胸腺激素之一.TP5 构效关系的研究表结构修饰,在TP5的N端或C端引入半胱氨酸,偶联马来明,Ang和Asp对保持TP5的生物活性极为重要。TPS的酰胺基聚乙二醇,修饰后的产物具备生物活性,可用于4-5位.1-2位及2- -3 位肽键是对酶敏感的部位,被酶解制备各种免疫疾病药物'。后可导致TP5活性降低或丧失.TP5注射于人体后很快1材料与方法由蛋白酶和氨肽酶降解为氨基酸,药物原型的半衰期仅1.1 主要仪器高效液相色谱仪,美国Alltech公司;分为30s,TP5稳定性差的弱点严重妨碍了它的药效,使在析柱Accurasil C18反相硅胶柱(4.6X250mm) ,大连依利临床用药时不得不增加剂量,导致治疗成本增加”。特分析仪器有限公司;制备柱Accurasil CIg 反相硅胶柱聚乙二醇(polyethylene glyol,PEG) 是具有不同相(19X250mm) ,大连依利特分析仪器有限公司,CHRIST对分子质量.重复乙二醇单元的直链或支链聚合物,无冷干机,北京博励行仪器有限公司;高速大容量离心机,免疫原性,水溶性强,巳被FDA批准用作药物修饰剂。上海安亭科学度计,上海光谱仪中国煤化工PEG分子量大于1000Da时无毒性,分子量低于30000Da器有限公司。YHCNMH G●351●承德医学院学报JOURNAL OF CHENGDE MEDICAL COLLEGEVol. 28 No.4 20111.2主要试剂Wang Resin,天津南开合成科技有限公mg)。取平均值测得Fmoc-Ty(Bu)- Wang Resin的替代度司,替代度为1.17mmol/g;各种氨基酸:Fmoc-Ty(tBu)为0.8mmol/g.OH、Fmoc-ValOH,Fmoc-Asp(OtBu)OH.Fmoc-Lys(Boc)-OH、2.3 TP5 的制备称取1gFnmo-TytBu) WangResin(0.8mmoD)Fmoc-Cys(Tt)-OH,苏州中科天马肽工程中心有限公司;加入多肽反应柱中,然后加入10ml 20%哌啶/DMF(V/V)缩合试剂:二异丙基碳二亚胺(DIC)苯并三氮唑-N,N,溶液,15min脱除Fmoc保护基,加入l0ml DMF洗两次,然N' ,N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU).1-羟基苯并三氮后再加入10ml 20%哌啶/DMF(V/V)溶液再次反应15min唑(HOBT).催化剂4-二甲氨基吡啶(DMAP),苏州中科全部脱除Fmoc保护基,反应结束后，分别加入10mlDMF、天马肽工程中心有限公司;裂解试剂:三氟乙酸(IFA)、DCM洗涤树脂三次,然后对Fmoc-Val-0H进行偶联。称量苯甲醚(anisole).苯甲硫醚(thioanisole).乙二硫醇(EDT),0.814g Fmoc-VaL_OH(24mmo).036mlDIC(2.4mmol)和0.406g均为分析纯阿拉丁试剂;TP5标准品,苏州中科天马肽工HOBt(2 4mmol),用适量的DMF溶解,然后加入到树脂中,程中心有限公司;单甲氧基聚乙二醇修饰剂(mPEG5000-反应时采用茚三酮显色法定性检测反应进程,反应完全MAL),北京凯正生物有限公司;乙醚和二氯甲烷均为分后,抽滤掉反应液。然后按照IPS的氨基酸顺序从N端到析纯。C端循环偶联Fmoc-Asp(OBu)-OH.Fmoc-ys(Bc)OH.Fmo>2方法与结果Arypb)OH用茚三酮显色法定性检测反应进程,2h反应完2.1 氨基酸树脂Fmo~Ty(tBu)- WangResin的制备把全,抽干溶剂,20%哌啶/DMF(V/N)溶液脱Fmoc半小时，0.851g Wang Resin(lmmo)投入到多肽反应柱中, 10ml DMF分别用DMF洗涤树脂四次、二氯甲烷洗涤三次,再用甲醇洗涤--次，抽干;10mlDMF常温溶涨,溶剂的体积控制洗涤三次,每次5min(以收缩树脂),得HAg(Pb)-LysBoc)Asp在5-10ml/g树脂,N2吹拂搅拌30min至树脂充分泡涨，(OBu)Val-Ty(Bu)Wang Resin。最后，用N2吹干溶剂,真空抽干液体;5mlDMF洗涤一次,抽千,10mlDMF洗涤干燥至恒重,得1.40g。一次,抽干。将1.378g Frmoc-Tyr(tBu)OH (4mmo).0.508g称取H-Arg(Pb)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Vl-Tyr(tBu)-HOBt(4mmo).0.6ml DIC(4mmol)溶解在5ml DMF中,加Wang Resin 0.7g置于50ml烧瓶中,然后加入10ml裂解液到反应柱中,反应5min后,加入DMAP,反应3h。反应结(TFA:EDT:苯甲硫醚:苯甲醚= =90:3:5:2)磁力搅拌2h,束后,抽干反应液,用10ml DMF洗涤三次抽千,随后将滤出液体,缓慢滴加至装有乙醚的血清瓶中,待其自然树脂转移到锥形瓶中,加入12ml封闭试剂(AC20/吡啶沉降,30min后撇除上清液,带有乙醚的TP5粗肽湿品进(5:1)) ,磁力搅拌反应过夜;10ml DMF洗涤两次,5ml无.行离心处理,弃去上清液,用乙醚研洗粗肽,再次离心，水甲醇洗两次(10min/次) ,真空减压千燥至恒重。取少以此循环上述两步操作四次。置空气中静置l5min后转许树脂进行替代度检测。移至真空干燥器中,进行减压干燥,将粗肽常温真空干2.2 Fmoc-Tyr(tBu) Wang Resin替代度的测定精 密燥过夜到恒重得0.28g。称取2份8mg干燥至恒重的Fmoc -Ty(tBu)-Wang Resin,2.4 Cys-TP5 的制备把HAg(b)-LysBoc)Asp(OBu)-分别置于lml离心管中,向离心管中各加入Iml 20%哌Val- TytBu) Wang Resin再次投到反应柱中，用10mlDMF溶啶/DMF(V/V)溶液,室温振荡20min,脱却Fmoc保护胀30min后,脱Fmoc 30min, 加入FmocCys(TIt)-OH.HOBT基。各取离心管中溶液200μl置于10ml比色管中，分和DIC。反应2h后,茚三酮法检测，反应完全。脱除Fmoc,别用10ml DMF稀释.摇匀,待测。将200ul 20%哌啶/将树脂洗涤收缩.干燥,裂解液(TFA:EDT:苯甲硫醚:苯DMF(V/V)溶液用10mlDMF稀释.摇匀,作为空白对甲醚= =90:3:5:2)裂解,乙醚析出沉淀,干燥至恒重。照液。于波长301nm处,用紫外分光光度计测定各溶液2.5 TP5 和Cys-IP5的分析和纯化粗品IP5和Cys-TP5的吸收值(A),并按照公式计算替代度:Sub=[AX5lV进行RP-HPLC分析,并与TP5标准品对照，检测波长为[ε xm*。式中,Sub为替代度,定义为每g树脂中连接215nm,梯度洗脱A :0.05% TFAH2O、B:0.05% TFA70%的氨基酸的毫摩尔数;A为测得的吸光度值;51为稀释CHzCNHO,流速为lml/min.TP5保留时间为19.932min,倍数;ε为Fmoc结构在301nm处的特征吸收值,数值Cys- -TP5保留叶间为21 27min吧HPLC分析纯度大为7.8L●(mmolxcm)";m为称取的树脂质量(单位为于95%。氨基中国煤化I後顺序符合。相同TYHCNMH G●352●.承._德医学院学报JOURNAL OF CHENGDE MEDICAL COLLEGEVol.28 No.4 2011梯度条件下,半制备型RP -HPLC纯化,冷冻干燥,得TP5进行保护,在EPH=7-8的溶液中可以完成对TP5的修饰。和Cys-TP5白色粉末。RP-HPLC可以随时监测反应进程,制备液相纯化简单高2.6 Cys(mE0o-MAL)-TP5的合成将4mgCys-TP5效。因为mPEG-MAL无紫外吸收,TP5被mPEG-MAL修饰溶于1ml水中,用NaHCO,溶液调pH=7- -8,加入50mg(3后,紫外吸收值明显降低。倍当量)的mPECo-MAL,室温反应,RP-HPLC监测反固相合成避免了液相合成过程中多步骤纯化,操作应进程Cys(mEG0o-MAL)-TP5保留时间为27.93min。简单的同时减少了产物损失,合成产物产率高。本研究3讨论采取Fomc固相合成Cys-TP5,弱碱性溶液中mPEG003.1氦基酸树脂 的制备和树脂替代度的测定多肽固相MAL和Cys-TP5结合,实现了TP5的PEG化修饰，虽然合成的第一一步通常是将第-一个氨基酸的羧基通过酯键或产率不高,但可延长TP5的体内半衰期,仍然不失为一酰胺键连接到树脂_上,这一步连接效率的高低不但直接种可行的方法。影响以后合成出目标多肽的得率,而且对下一个氨基酸[参考文献]的用量具有重要的指导作用。因此,本合成选择的树脂[1] Liang Yong-tao, Mi Hao-yu, Wang Ming zhe, et al Solid-phase是Wang Resin, 该树脂结构较小替代度较高。TP5仅有synthesis of thymopentin derivative and is immune regulatoryactiviyJ.Chem Res Chinese Univasities 2009, 25(2):189-192.五个氨基酸,不易形成蛋白质的螺旋或折叠结构,用高替[2] Onoue s, Liu B, Nemoto Y, et al. Chemical synthesis and代度的树脂可以提高原料的利用效率,降低合成成本。本application of C-terminally 5-carboxyfluorescein- labelled研究中使用的Wang Resin原替代度为1.17mmol/g,接第thymopentin as a ftuorescont probe for thymopoictin recepor小Anal Sci, 20060 22(12): 1531- 1535.一个氨基酸Fmoc-Ty(Bu)-OH时,增加投料,延长反应时[3] 陈艳丽. 多肽片段连接.衍生物及偶合物的化学合成研究间,加入一种新型的酰化催化剂DMAP,得到合适替代度[D].山东大学,2009.的树脂。本研究制得Fmoc-Ty(Bu) Wang Resin的替代度为[4] 姜忠义,许松伟， 王艳强.蛋白质和肽类分子的聚乙二醇化化学[].有机化学,2003,23(12):1340-1347.0.8mmol/g,偶联四个氨基酸时投料比控制在1:3,最后合[5] 潘和平,王良友,邵宁生,等.胸腺五肽的聚乙二醇化成的产物较纯,且充分利用原料,使得合成成本降低,适宜術生物，含有它们的药物组合物及用途[P].中国专工业化生产TP5。利:200310117356,2005- 06-15.3.2 PEG 对TP5的修饰- 般的PBG 修饰物对多肽的游[6] 石卫华, 田素梅,项光亚,等.西曲瑞克固相合成J].中国药物化学杂志,2010,20(1):40- 43.离氨基没有选择性,当有多个氨基时往往难以实现定点的[7] 宓鹏程, 朱颐申,张琪,等.固相合成胸腺五肽[].有机化PEG化修饰,分析和确定产物中PDG的修饰位点也较难”。学,2007,27(12):1525-1529.基于这一点,本研究在TPS的基础上引入半胱氨酸,并选[8] 王良友, 刘克良.多肽和蛋白质的聚乙二醇化修饰方法0.有机化学, 203,1(23); 1320-1323.择仅与半胱氨酸的巯基反应的mPEG-MAL,无需对氨基酸(收稿日期:2011-06-13)分光光度法测定山玫胶囊中总黄酮的含量杜义龙,李艳荣,王领弟,潘海峰,张晓峰^(承德医学院中药研究与开发重点实验室,河北承德067000)[摘要]目的:建立山玫胶囊中总黄酮含量的测定方法并测定其含量。方法:以芦丁为对照品采用分光光度法于510nm处测定御室金丹药业山玫胶囊和实验室自制山玫胶囊总黄酮的含量。结果:回归方程为Y=l2.602X-0.0216,芦丁在0.8X 10 2mg/ml- 4.8X 102mg/ml线性关系良好(r =0. 996),回收率为98.6%，RSD为1.75%。含量测定结果表明，御室金丹药业和实验室自制的山玫胶囊总黄酮含量差异不明显。结论:该方法简便、准确、可靠,可用于山玫胶囊中总黄酮的含量测定。[关键词]山玫胶囊;总黄酮;芦酊;分光光度法中国煤化工[中图分类号]R917[文献标识码]A [文章编号1]1004- 6879(20MYHCNMH GO通讯作者●353●