喜树碱-聚乙二醇前药的合成及体内外释药特性

中圃奠科大学学报142Journal of China Pharmaceutical University 2012 ,43(2):142 - 146喜树碱-聚乙二醇前药的合成及体内外释药特性徐蓓华",周惠燕(浙江医药高等专科学校,宁波315100)摘.要为提高喜树碱(CPT)在体内的代谢稳定性,合咸喜树碱聚乙二醇葡药。以聚乙二醇为原料,经过端基活化，与喜树碱20-位痊基反应得到目标化合物(6a6e),分别用IR.'H NMR对化合物6a6e进行了结构表征。用HPLC法测定化合物6a6e在磷酸缓冲液(pH 7.4)中释教的喜树碱浓度，以及大鼠血浆中释放的喜树碱浓度。结果表明化合物6a-6e在磷酸緩冲液中24 h的药物释放速率在11% -S2%之间;大鼠尾静脉给药,衰明化合物6a6e的AUC为CPT溶液剂的4.38倍至6.67倍。化合物6a6e具有比CPT更好的体内稳定性,有望延长药物体内半袁期及提高生物利用度。关键词喜树碱;聚乙二醇;前药;合成中图分类号R944 文献标识码 A文章编号 1000 - 5048(2012)02 -0142 -05Synthesis and characterization of camptothecin-polyethylene glycol ester pro-drugsXU Bei-hua ' , ZHOU Hui-yanZhejiang Pharmaceuical College, Ningbo 315100, ChinaAbstract To improve the metabolie stability of camptothecin (CPT) in rivo, a series of 20-PEG-linked campto-thecin prodrugs were synthesized. After activation of hydroxy groups at the two ends of polyethylene glycol( PEG), CPT was coupled to the activated PEC to give the targeted products 6abe. The chemical structures of 6a-6e were characterized by IR and 'H NMR . HPLC method was used for the determination of CPT concentration inPBS buffer ( pH 7. 4) and in plasma of rats. Drug releasing rates from 6a6e in PBS buffer (pH 7.4) were 11%-2% within 24 h. When given to rats intavenously, AUC of compounds 6a-6e were 4. 38 to 6. 67 fold higher thanthat of CPT solution. Compunds 6a-6e have longer circulation efects, subtantially greater than CPT. They canprolong biological half-life and improve the bioavailability of camptothecin.Key words camptothcin; polyethylene glycol; prodrug; synthesisThis study was sppred by the Scientific Research Project of Zhejiang Pharmaceutical Clle (No. ZPCSR200600)喜树碱(CPT)是一- 种拓扑异构酶I抑制剂,临本研究采用传统的前药方法,选择可降解的水溶性床试验表明对胃肠道肿瘤、膀胱癌、肝癌和白血病高分子聚乙二醇( PFG)来修饰高树碱,修饰的位点等多种恶性肿瘤有效。但其体内半衰期很短,约为内酯环上20-位的羟基。聚乙二醇的修饰可避1.5 h。研究表明,喜树碱结构中的内酯环及20-羟免药物被网状内皮系统谷噬，延长药物在体内的循基是活性必需的,而喜树碱的内酯环在人血清中迅环时间;PEG产生的空间位阻,可提高喜树碱内酯.速开环(约11 min) ,其开环产物的活性仅为喜树环的稳定性,另外PEG可提高药物的水溶性及肿碱的1/10,且副作用增大"。另外喜树碱的水溶瘤组织的被动聚集效应,增强药物的疗效2。性很小,这也影响了它在临床上的使用。为了考察不同相对分子质量的PEG,以及与喜为了延长喜树碱的半衰期,提高它的水溶性，树碱的不同结合 方式对前药水解速率和体内代谢方收稿日期211-1104 ● 通讯作者Tel;0574 822279393 E-mail:x中国煤化工基金项目浙江医药高等 专科学校科研课题责助项目(Ner ZPCSR20060:YHCNMHG.第2期徐蓓华等:喜树啵-聚乙二醇前药的合成及体内外释药特性143式的影响,合成了5个化合物(6a6e) ,见路线1。BrCCO.E1R.RIRy1.NaOHHO-PEG-OH1BuOK- + EO:C--O-PEGO-S -CO2Et 2HC+ HOC--ofPEGo-C-cOH- +H13c--OFPEC+0-DCC, DMAP~6m-6e3a: PEG-6k R-= H.3b: PEG-20k. R1=H: 3e: PEG-6k, R;=CH3↓6: PEG&k, R- H, 6lr PC_20,H, bePEGC6HR-CH, ;CH, 0R2C-0-C-NH-CH-C0OHRHy00C-CH- NHCF:COOH一R &RRg R‘0-0C-CH-INC-C-0-PEGo-C- - CNH-CH-C0-0*AEEDQ, DMAP6d-6e6d; PEG-6k. RI- H.R2= H. be: PE0-sk, R- H. Rx- CH3Scheme 1 Synthesis of corpounds 6a6e光光度计(上海精密科学仪器有限公司);U3000高效液相色谱仪(紫外检测器为SPD-10A型,美国1材料戴安公司) ;BS1I0S系列电子天平(北京赛多利斯1.1药品与试剂天平有限公司)。喜树碱(黄石飞云制药有限公司,批号: .1.3动物081101 ,未经处理直接使用);聚乙二醇-6k ( PEC-清洁级SD大鼠,雌雄各半,体重(270 +20)g, .6k)、聚乙二醇-20k (PEG-20k)、二甲氨基吡啶由浙江医学科学院提供,动物合格证号: SCXK(DMAP)澳代乙酸乙酯、溴代丙酸乙酯、叔丁醇(浙)20080033。钾、二异丙基碳二亚胺( DIPC)、2-乙氧基1-乙氧羰2方.法基-1 ,2-二氢喹啉( EEDQ)、2-氯-1-甲基碘代吡啶,以上试剂均为化学纯，购自中国国药上海化学试剂2.1化学合成[3-5]公司;其余试剂均为市售分析纯。叔T醇及二氯甲2.1.1聚乙二醇二乙酸(3a) 将 PEG-6k(1)烷使用前须做无水处理。8.0g(1.3 mmol)溶于甲苯100 mL中,共沸除水1.2仪器1 h,蒸除甲苯,冷至室温,加人叔丁醇100 mL,叔Avance500型核磁共振波谱仪(CDCI为溶丁醇钾4.5g(39.0mmol),搅拌至固体全部溶剂,TMS为内标);170SX型傅里叶变换红外光谱中国煤化工0 mmol) ,加热仪( KBr压片,美国Nicolet公司) ;752紫外可见分. 回流YHC NMH G', 加硅藻土抽144中圃果科大學学报Journal of China Pharmaceutical Universiry第43卷滤,减压蒸除溶剂。残余物用二氯甲烷10 mL溶(20 mL x2)洗涤,无水硫酸钠干燥过夜,减压蒸去解,搅拌^下慢慢倒入乙醚150 mL.中.析出白色固溶剂，残留物用异丙醇重结晶(400 ml x3),此时体.抽滤得聚乙二醇二乙酸乙酯(2)7.4 g,产率在TLC板的原点处有亮紫色斑点,其他位置无杂92.0%。IR (v):3 424,2 889,1 747(C=0),斑(履开剂为乙酸乙酯-石油醚,2:1)。产物为浅黄.1 468,1 114 cm"。色固体(6a)2.32 go将化合物2 7.0 g(1.2 mmol)投入1 mol/L以化合物3b代替3a,用类似方法制备6b,产NaOH 36 mL中.室温搅拌4 h,在冰水冷却下,用物为浅黄色固体。以化合物3c代替3a,用类似方2 mol/L HCl调pH至3.0,用二氣甲烷( 12 mL x3)法制备6c,产物为浅黄色固体。提取,合并有机层,用水25 ml,洗,无水硫酸钠干燥2.1.3 甘氨酸20-喜树碱酯三氟乙酸盐(5a) 将过夜，减压蒸除二氯甲烷,残留物用异丙醇60ml.Boc-甘氨酸1.8 g(9.3 mmol)、喜树碱(4) 1.1 g重结晶，干燥后得白色固体(3a)6.2 g, 产率88. 6(3. 1 mmol)溶于二氯甲烷700 mL中,降温至0 C,%。以PEG-20k 代替PEC-6k,用类似方法制备加入DIPC 1.5 mL(9.3 mmol)和DMAP 0.76 g3b:产率85%。(6.3 mmol) ,升至室温.搅拌反应24 h,用0.1 mol/L以a-溴代丙酸乙酯代替溴代乙酸乙酯,用类HCl溶液(90 mL x2)洗涤,无水硫酸钠干燥过夜，似方法制备3c:产率83%。减压蒸去溶剂，残留物用甲醇45 mL重结晶,得黄2.1.2聚乙二醇二乙酸二(20~喜树碱) 酯(6a)色结晶1.26 g,产率94%。将化合物3a3.0 g(0.5 mmol)投人甲苯s0 mL中,将以上产物1.2g溶于二氯甲烷15 mL中,加共沸除水0.5 h,蒸除甲苯。加入二氧甲烧80mL，人三氟乙酸 I5 mL。将反应液倒入乙醚100 m在0~5 C下加入喜树碱0.8 g(2. 3 mnol) , DMAP中,抽滤,得黄色固体。用二氯甲烷乙醚(1:4)再1.0g(8.0 mmol)和2-氯-1-甲基碘代吡啶1.0 g次重结晶，得浅黄色固体(5a)1.2 g,产率83%。(4. 0 mnol) ,继续在冰浴中搅拌1 h,然后升至室以Boc-丙氨酸代替Boc-甘 氨酸,用类似方法温,反应18 h。抽滤,滤液用0.5 mol/L HCl溶液制备5b,为浅黄色固体,产宰80%。Table 1 Speeroscopie dnta of compounds 6a6eCompd.__ YietlU% IR( KBe,r)/m-TH SMIR (CDCI .8)6n672888,1 970,1 755,1 653,1 602，0. 98(3H,1,18-CH,) ,2 29(2H,m,19-CH2).3. 43-3.79(467H, m,PEG),1468,1 343,1 281,1 242,4. 34(2H,CH2CO) ,5. 30(2H,8.5-H).5.40( lH,d,17-H) ,5.67(1H,1 102d,17-H) ,7.25(H,s,Ar-HI),7.67<(lH,m. ArH),7.84(1H,m, Ar-H),7.94(1H,d,Ar-H) ,8. 2(1H,.A-H) ,8.40(H,e,Ar-H)Sb702 88.8 970,1 755,1 620,1 468，0.95(3H,1, 18-CH,).2.27 (2H, m, I.CH2)3433.81 (131H, m.,1 343,1 281,1 242,1 100PEG),5. 27(2H,s,5-H).5.64(1H,d,17-H).5.68(1H,d,I7-H),7.25(IH,s, Ar-H) ,7.66(IH,m,Ar-H).7.82( IH.m,Ar-H) ,7.91(1H,d, Ar-1),8. 18(H,d,Ar-H) ,8.39(1H,s,ArH)6S288.1 753,1 663,1 468,1 360，1.02(3H.18-CH)1.45(3H,d.LCH,).2.30(2H,.m. 19-CH.),3.47-fec1 343,1 281,1 1093. 82(489H,m,PEG) ,5.29(2H,5H) .s. 41(1H,d.17-H) ,5.64(1H,d,17-H) ,7.67(1H,m, Ar-H) ,7.85(1H,m, Ar-H) ,7.96(1H,d,ArH),8.20(1H,d,Ar-H) .8.42(1H,s,Ar-H)id682 88,1 756,1 66,1 602,1 468,0. 9(3H,18,8CH4),2. 30(2H,m,19-CH2),3.47-3. 84(439H, m,PEC),1360,1 342,1 281,1 242,1 1084. 47(2H,d,CH2.CO) ,s.30(2H,5.5-H) ,s.43(1H,d,17_H) ,5.67(1H,d.17-H),7. 59(IH,, Ar-H),7.68(1H,t, A-H),7.84(IH,t, A-H),7.94(1H,d,Ar-H) ,8.25(1H,d.Ar-H) .8. 42(1H,3,Ar-H)5e62888.1 754.1 620,1 468.1360，0. 9(3H,1,18.CH4).L.54(3H,m, -CH,).2.28(2H,m,19-CH2),3.46.1342,1 281,1 242,1 1023.81(1044H, m, PEC),4.84(1H, m. CHCO),s.29(2H,s, 5.H),5.40(1H,d.17-H),5. 69(1H. d, 17-H),7.66(IH,1, A-H),7.82(1H,I, ArH).Z. 94(H,d.ArH) & 23(UH.d.A-H) .8.41(UH,s,A-H)2.1.4聚乙二醇二乙酰甘氨酸二(20喜树碱) 酯苯3.中国煤化工苯15 mL,冷(6d)将化合物 3a 0.22 g(0.04 mmol)投入甲，却至0.20 mmol) ,*TYHCNMHG第2期徐依华等:真树贼聚乙二醇前药的台成及体内外释药特性145EEDQ 0.05 g(0. 18 mmol)和DMAPO.08 g(O. 6.(1:3)400 μL,擺匀,离心后取上清液进行HPLCmmol) ,55 ~60 C搅拌反应12 h。抽滤,减压蒸检测。色谐条件同“2. 3”项。去溶剂,残留物用异丙醇重结晶。产物为浅黄色3结果与讨论 .固体(6d)0. 18 g。以化合物5b代替5a,用类似方法制备,得浅3.1化合物6a-6e 中喜树碱的含量黄色固体6e。本实验中的双羧基端PEG制备未采用传统2.2含量测定的琥珀酸酐法引人羧基*1,而通过PEC与a-卤以甲醇为溶剂,将喜树碱标准品配成浓度为代羧酸酯的氧烃化反应引人。喜树碱与PEG的3~ 30 umol/L的5个标准溶液,测定在370 nm下结合率普遍不高,见表2。PEG 分子两端应能接的吸收度(A),以依度c对吸收度进行线形回归,两个药物分子,本实验中平均只接了0.6-1.3得标准曲线:A =0. 0220 +0.0273c (r =0. 99)。个药物分子。这可能与PEG端基活化不完全有精确称取化合物6a-6e,用甲醇配成适当的浓关,另外喜树贼20-位羟基存在较大位阻.也增加度,在同一波长下测定吸收度。根据标准曲线计算了结合难度。喜树碱的浓度。喜树碱的重量与称取量之比,即为在PEC端基活化制备过程中,无水条件的控质量百分比(四)。喜树碱的摩尔数与称取量的前制显得很重要。PEG 分子中结合有水分子,无法药摩尔数之比，即为摩尔百分比(x)。通过减压十燥等手段除去,本实验中采用甲苯带水2.3体外释药试睑的方法。根据文献[9],甲苯也是合成反应的溶将精确称取的喜树碱标准品及化合物6a6e剂,但研究发现,叔丁醇钾不能很好的溶解。因此，分别投入透析袋(透过相对分子质量3500),再加将甲苯全部蒸除,换成尤水叔丁醇作为溶剂。人磷酸缓冲液(PBS,pH 7.4) 2 mL,束紧袋口,分Table 2 Carnptohecin( CT) content of compounds 6abe别投入PBS溶液28 mL的锥形瓶中，置37 C恒温w(CPT)/呢x(CT)水浴锅中。按设定时间间隔取出PBS溶液5a6.51.221.10.5ml,并补充相同体积的新鲜PBS溶液，用高效1.液相法检测PBS溶液中再树碱含量。0.色谱条件如下。色谱柱:ODS Ci柱(250 mmx4. 6 mm,5 μm);流动相:甲醇水(60: 40);流速:3.2体外释药1.0 mL/min ;检测波长:370 nm ;进样最:20 pL。前药的稳定性与喜树碱的内酯环稳定性存在标准曲线的绘制:取CPT5 mg,精密称定,以着正相关性。研究表明，喜树臧的内酯环在20-位甲醉配制成质量浓度为0.04,0.1,0.15,0.3,0.5，羟基 与PEG成酯的状态下是不会被打开的,这样2.0,5.0,20.0 mg/L的CPT系列溶液，进样,记录前药形式就保持了喜树碱的活性”。色谱图。以峰面积(A)为纵坐标，CPT质量浓度从图1可见,PEG的相对分子质量可影响前药(<)为横坐标,进行线性回归,得回归方程:A =水解速率:与化合物6a相比,6b的水解速率有所0.797c-0.0231(r=0. 9996)。减缓。PEC高分子呈螺旋线结构,相对分子质量2.4体内药代动 力学预试{0-)1的大小可能引起了螺旋半径,及疏密程度的改变,将健康SD大鼠随机分组.每组3只,分别经导致水解速率的差异,但影响不是很大。尾静脉级馒注射CPT及化合物6a-6d溶液制剂,剂与化合物6a相比,6c的水解速率显著放慢,量以CPT计为3.5 mg/kg;分别于0.25,0.5,1,2,与它的酯键a-位甲基取代形成的空间位阻有关。3,5,7,9,11 h经尾静脉取血0.5 mL,全血置涂有与6a相比,6d由于引入甘氨酸做连接臂,水解速肝素的干燥EP管中.4 000r/ min离心10 min分率有所增大;6e引人丙氨酸,由于酯键x-位甲基形离血浆,-20 C冷冻保存。成的空间位阻,使水解反应减缓。所以我们可以通血浆样品的处理精密移取大鼠血浆200 μl，过改变 PEG相对什子质量的大小C以及键合的形加入磷酸20 μ山,摇匀.避光放置2 h;加甲醇乙腈式来得中国煤化工YHCNM HG146中国善科大学学报Jourmnl of China Pharmaceuical Uninersity第43卷容易代谢;另一方面由于化合物6a相对分子质量较小,更有利于通过肾小球滤过方式代谢,而化合40-物6b的相对分子质量比6a大很多,不容易透过肾小球。化合物6c和6d由于键合方式与6a不同,其MRT都比a大,应该由其水解速率差异引起。化合物6c在体外PBS(pH7.4)缓冲溶液中表现s10152025.很稳定,在体内同样不容易被酶促代谢水解。虽/min然化合物6c的相对分子质量比6b小,但MRT和-+-6a:一- 6b;-1-6c:-●- 6d:;-0-6eFigure 1 Kinetics of CPT release from corpounde 6a6e in PBS bufferAUC与化合物6b差别不大,可见化合物6c的键(pH7.4)合方式，即酯键旁增加小基团,对延长药物体内3.3体内 药代动力学作用时间很有利;同时也说明前药在体内的消除化合物6a6d及CPT溶液制剂的血药浓度经方式还是以代谢为主,肾排泄为次。时曲线(图2)显示，化合物6a-6d的血浆内CPT消参考文献除速度明显低于CPT溶液制剂，循环时间延长。根据3P97药代动力学程序可初步获得6a6d及[1] 2hao H,Lee C,Sai P.ct a. 20 0-Aegykempohein devative:evidence for lartone sabiliation [J]. 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