末端连接ω-氨基酸的聚乙二醇修饰剂的制备

Vol. 33 No.2华东理工大学学报(自然科学版)1812007-04Journal of East China University of Science and Technology (Natural Science Edition)文章编号:1006- 3080(2007)02-0181-05末端连接o-氨基酸的聚乙二醇修饰剂的制备熊玉春'，刘清海'， 何明磊”， 魏东芝'(1.华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,鲁华生物技术研究所,上海200237;2.大连民族学院生命科学学院,辽宁大连116600)摘要:提出了一种新型聚乙二醇(PEG)修饰剂的合成方法。首先以两种w氨基酸和单甲氧基PEG为主要原料,经连接、纯化和水解等步骤,得到末端以酰胺键连接wr氨基酸的PEG酸,再将得到的PEG酸用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)进行活化,得到聚乙二醇β丙氨酸-N~羟基琥珀酰亚胺酯(PEG- BPA-NHS)和聚乙二醇r氨基丁酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(PEG-GABA-NHS),总收率为60%。这类新的修饰剂经验证具有较长的水解半衰期(分别为7.6 min和16. 7 min)和良好的蛋白修饰能力。关键词:聚乙二醇;w氨基酸;聚乙二醇修饰;活化;制备中圄分类号:0633. 11文献标识码:APreparation of Two New PEG Reagents with o-Amino Acid TailXIONG Yu-chun'，LIU Qing-hai'，HE Ming-lei'，WEI Dong-zhil(1. State Key Laboratory of Bioreactor Engineering , New World Institute of Biotechnology,East China University of Science and Technology , Shanghai 200237, China;2. College of Life Science, Dalian Nationalities University, Dalian 116600, Liaoning, China)Abstract: A synthesis method of a new type PEG reagent was proposed, in which firstly new polyeth-ylene glycd (PEG) acids with wramino acid tail were prepared, from two wramino acids and mPEG by stepsof acylation, purification and hydrolyzation, subsequently the PEG acids were activated by NHS, which ledto the production of PEG BPA-NHS and PEG-GABA-NHS respectively (total yield 60%). The productswere proved to have a favorable half-life (7. 6 min and 16. 7 min respectively) and PEGylation activities,and belong to the second-generation of PEG derivatives family.Key words: polyethylene glycd; w- amino acid; PEGylation; activation; preparation聚乙二醇(PEG)广泛应用于生物医药修饰领.作为药物缓释介质的能力。域。PEG修饰的酶分子可溶于有机溶剂,均相中更PEG是- -种两端以羟基为末端的线型聚合物。有利于有机相酶反应的进行;PEG修饰的蛋白质可由于两端均具有可反应的活性基团，易导致被修饰减少蛋白的免疫原性、降低肾脏排除速率,并可促使分子之间的交联。除了一些有特殊需要的场合之结合物在血液循环中的半衰期增加;PEG结合到脂外,更多用于多肽和蛋白，质修饰的是单甲氧基聚乙质体_上可以使其半衰期有极大增加,并能够增加其二醇(mPEG) .中国煤化工收稿日期:2006-05-22TMYHCNMHG基金项目:国家863重大专项基金资助(2002AA2Z3451);上海市重点学科资助项日作者简介:熊玉春(1977-),男,何南南阳人,博士,现从事创新药物的开发研究。通讯联系人:魏东芝, E-mailidzhwei@ecust. edu. cn182华东理工大学学报(自然科学版) .第33卷PEG的末端羟基不能直接与蛋白分子发生反1实验部分应,需经活化才能够与相应的氨基酸残基基团发生反应。目前应用最广,技术最成熟的修饰方法是对1.1实验材料和仪器蛋白分子中氨基的化学法酰化修饰。mPEG5000购自Fluka公司;N-羟基琥珀酰亚修饰剂的反应活性影响其修饰效果。高反应活胺(NHS)购自Sigma公司;丙氨酸、二环已基碳二性的修饰剂与目标蛋白的反应速度快,修饰剂本身亚胺(DCC) ,分析纯,购自国药集团上海化学试剂公对目标蛋白上不同位置的氨基位点缺乏选择性,从司;r氨基丁酸,分析纯,购自上海试剂三厂;叔丁醇而导致蛋白质的活性位点也被无差别地修饰而失钾购自Acros 公司;溴乙酸乙酯,分析纯,购自上海活;而反应活性较低的修饰剂则可以在保证修饰反天莲精细化工有限公司,rhIFNa2b由上海华新生应正常进行的前提下,具有较低的修饰速度,从而有物技术公司提供; QAE Sephadex A50购自Amer-利于获得较高的修饰选择性。sham;甲苯、二氯甲烷等均为市售分析纯试剂.现有的一些PEG羧基NHS活化酯的水解半1.2实验方法衰期一般为20min左右,不同结构的羧基活化酯由1.2.1 末端以酰胺键连接w氨基酸的PEG酸的于其PEG主链末端的非醚碳链不同而有活性上的制备(1)羧甲基化聚乙二醇(CM-PEG)的制备:差异。羧甲基化PEG-N-羟基琥珀酰亚胺酯(SCM-将10 g(2 mmol)mPEG5000溶于300 mL甲苯中，PEG , PEG-CH2COONHS)和N-羟基琥珀酰亚胺蒸馏出约70mL溶剂以共沸除水,然后加入0.34g酯基碳酰PEG酯(SC-PEG,PEG-OCOONHS)制备(3 mmol)叔丁醇钾回流反应1.5 h,缓慢加人335较为简单,前者可以先用mPEG-OH通过William-μL(3 mmol)溴乙酸乙酯回流反应3 h,室温下反应son法制得CM-PEG,再用NHS进行活化而得10h,过滤除去沉淀,减压蒸去溶剂，残留物加少量到”,由于其反应活性太强,在典型条件下的水解半二氯甲烷溶解,用干燥乙醚沉淀,将沉淀物溶于去离衰期只有0.75 min,故此贮存和使用都不方便;后子水中,加入0.1 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH者则是用mPEG-OH直接用三光气活化得到[2 ,虽为10,然后用w=0.01的草酸溶液调节溶液的pH然合成简便，而且反应活性也较为适中,但其在对蛋为3,将此溶液用等体积的氯仿萃取3次,合并有机白进行修饰后,修饰产物中仍有一个酯键存在,会使相后,无水硫酸钠干燥,浓缩后用乙醚沉淀得到9. 6PEG链因水解而脱落。由于存在这些缺点,研究者g白色粉末(得率96%),即为CM-PEG,分子式为将这两种修饰剂以及有同样缺点的其他一些修饰剂CH,O- (CH2CH2O),- CH2COOH。定义为第1代修饰剂。而将符合水解半衰期较长，(2) w氨基酸乙酯盐酸盐的制备:将0.2 mol β结构中不含酯键结构等特点的修饰剂定义为第2代丙氨酸(17.8g)或r氨基丁酸(20.6 g)加人到300修饰剂”。目前第2代修饰剂正在成为研究和应用mL无水乙醇中,在搅拌下通入干燥的氯化氢气体的重点。直到饱和，继续搅拌2 h后加入无水乙醇,减压蒸第2代修饰剂的代表丙酸PEG-N-羟基琥珀酰馏,除掉多余的氯化氬,将溶液浓缩至约70mL,用亚胺酯(SPA-PEG, PEG-O-(CH2 )2COONHS)系列无水乙醚沉淀得到粉末29.2 g(F-丙氨酸乙酯盐酸修饰剂虽然半衰期较长,但是它们的合成都要首先盐 ,得率95%)或31.4 g(r氨基J酸乙酯盐酸盐，由mPEG-OH通过烷基化反应得到相应的羧酸,这得率94%)。-过程中要利用强碱和强酸在水相中进行[4,容易(3)末端连接w氨基酸乙酯的PEG的制备:取导致PEG主链的断裂。因此,开发- -种新型的、合6 g(1. 2 mmol)CM-PEG溶于20 mL干燥的三氯甲成条件温和的、半衰期较长的羧基型第2代PEG修烷中,然后依次加人0. 41 g(2 mmol)DCC,0. 31 g(2饰剂十分必要。mmol)f丙氨酸乙酯盐酸盐,或0. 33 g(2 mmol)r本研究提出以w氨基酸为原料对羧甲基化氨基丁酸乙酯盐酸盐,然后向反应体系内加入280PEG进行活化的思路,合成了两种新型羧基PEGμL(2 mmol)三乙胺,密闭搅拌反应12 h,过滤除去修饰剂,其PEG末端带有一定长度的非醚碳链,且沉中国煤化工得到白色粉末5.7分子中不含额外的酯键结构,有利于修饰后仍能保g(wr氦基酸乙酯的持修饰剂与蛋白之间良好的稳定结合，这些都符合PEGfYHCNMHG第2代修饰剂的要求。(4)末端连接wr氨基酸乙酯的PEG的纯化:将QAE Sephadex A50 (Amersham Biosciences, Swe-第2期熊玉春，等:末端连接r氨基酸的聚乙二醇修饰剂的制备183den)溶胀后装人4 cmX60 cm的层析柱(上海华美其终态吸光值(Ao)为原料全部水解后产生的生物工程公司)中,用10 mmol/L,pH 8. 9的硼酸缓吸光值,所以冲液充分平衡后,将.上步中所得的反应混合物1.0gAo=k'co+b用2 mL平衡缓冲液溶解,上样后用0.5 mL/min的根据一级反应动力学方程速度洗脱,用碘显色反应指示PEG,直到有PEG流dc1/dt= kc1出即开始接收,待流出液中无PEG时,合并接收的结合上述的浓度以及吸光值的关系式可将动力溶液。将此溶液用等体积的氯仿萃取3次,合并萃学方程变换为.取液,并用无水硫酸钠干燥后,经旋转蒸发浓缩,过ln(1- A/Ao) =-kt +ln(1- b/Ao)量的无水乙醚沉淀,得到白色粉末0. 82 g(得率令a=ln(1- b/Ao),则得82%) ,为纯化后的末端连接r氨基酸乙酯的PEGln(1- A/Ao) =-kt +a (a 为常数)未反应完全的CM-PEG可经由500mmol/LNaCl本实验利用紫外分光光度计跟踪检测所制备的溶液洗脱。PEG活性酯在260 nm下生成NHS的情况。称取(5)末端以酰胺键连接r氨基酸的PEG酸的约10mg的PEG-NHS酯溶于3.0mL的pH8的获得:将5.0g上一步所得的分离产物干燥后溶于0.1 mol/L磷酸缓冲液中,对此溶液在260 nm下的去离子水中,加入0.1mol/L氢氧化钠溶液调pH吸光值A进行跟踪记录,并测得终态吸光值Ao,用至11,搅拌反应2 h,然后用草酸将溶液调节到pHln(1- A/Ao)对时间t作图,所拟合直线斜率就是水3,用氯仿萃取3次,合并有机相并用无水硫酸钠干解反应的一级速率常数的相反数( -k).燥,溶液浓缩后再用无水乙醚沉淀得到mPEG-根据~级反应的半衰期计算公式CH2CONH-(CH2),COOH(n=2或3),即以酰胺t/z = (ln2)/k键与PEG连接的PEG-f丙氨酸(PEG-BPA)(4.7计算得到PEG活性酯在实验条件下的水解半g,得率94%)和PEG-r-氨基丁酸(PEG-GABA)衰期。(4.7 g,得率94%)。1.2.4 PEG-酰~a氨基酸的 NHS酯与蛋白质的连1.2.2末端连接 w氨基酸的聚乙二醇活性酯的制接用pH 5. 0的磷酸缓冲液(100 mmol/L)将干扰备取上述制备的PEG-BPA(或PEG-GABA) 5 g素INF-a-2b配制成1 mg/mL 的溶液，按照干扰素(1 mmol),溶于干燥精制的无水二氯甲烷中,依次与活化酯的质量比为1 : 3的量加入活化酯进行修加入0. 25 g(1. 2 mmol)的DCC、0. 14 g(1. 2 mmol)饰,于室温下振荡反应2 h,用2 mol/L的甘氨酸终的NHS,室温密闭搅拌反应24h,停止反应过滤掉止反应,SDS-PAGE分析结果。沉淀,溶液用无水乙醚沉淀得到白色粉末4.4 g(得率88%),为PEG-酰wr氨基酸的NHS酯。分子式2结果与讨论如下:mPEG- CH2CONH-(CH2),COONHS(n=2或3)。2.1 PEG-酰-∞o氨基酸 的合成与活化1.2.3 PEG 活性酯的水解速率羧基型 PEG活以两种wr氨基酸为原料合成了两种新型的第2性酯在一定条件下的水解速率可以表征该活性酯的代PEG活化酯类修饰剂。其分子中不含额外的酯修饰反应PEG-COO- -NHS + OH- →键结构,保证了修饰后仍能保持修饰剂与蛋白之间PEG- -CO0O~ + HO- -NHS活性,其水解符合一级.良好的结合,避免了第1代修饰剂SC-PEG修饰后反应动力学模型。此类活性酯水解后释放出NHS易水解的缺陷。分子,在pH8的条件下于260nm有强的紫外吸以β-丙氨酸为原料,经连接、纯化、水解之后得收5]。到产物PEG-BPA,其' H-NMR (DMSO)8X 10°:记PEG- -CO0O- NHS 的浓度为c,初始浓度2.43(t, 4H,- -CH2-CO- -);3. 21 (s,- -OCH),为co,水解过程中HO- -NHS的浓度为c2,则3. 50(s,- OCH2CH2O- -),7. 18(t, 1H, CONH)。co=c+c;IR/cm=1. 1 629CONH).1 740(COOH)。在线性范围内,可以用吸光值A的大小表示生中国煤化工步骤所得的产物成的HO- -NHS的浓度,即PEG-YHCN M H G(CONH),1 740A=k'cz+b(COOH).其中b为空白吸光值,k'为常数。光谱分析表明，中间产物PEG-BPA和PEG-华东理工大学学报(自然科学版)第3卷GABA分子中均含有酰胺键结构,表明已将wr氨基素rhIFNa-2b进行了修饰,得到的修饰产物电泳结酸部分成功地接人到PEG链上。此两者分别用果如图2所示。从图可以看出,新合成的修饰剂能NHS进行活化后,即得到了可直接用于蛋白质修饰够较好地对蛋白进行修饰,修饰后产物的蛋白电泳的新型PEG活性酯。中多了若干条高分子量的条带,这些条带按相对分2.2PEG活性酯的水解速率子量由低到高依次为干扰素rhIFNa-2b的单修饰两种PEG活化酯的半衰期测定结果如图1和条带和多修饰条带。图中箭头所示为原料的单修饰图2所示。条带(M,=2.9X10*).一般来说,PEG的单修饰产物可以较好地保留目标蛋白的原始生物活性,是-0.8rA-NHSPEG修饰产物中值得分离的部分。对照同类文献(@) P0.095-0.42 2-1.2R2=0.099 98中采用商业化PEG活性酯对干扰素rhIFN ar2b修饰,在优化修饰条件后,修饰产物中单修饰带为约33%1],而图中的单修饰条带经纯度扫描含量均达-2.00 12到30%以上,证明所合成的新型修饰剂具有良好的1/min修饰效果。-1.0r(b) PEG-GABA-NHSMx10-4y=0.041 6x-1.22719.74-2.0-R2-=0.099 99: 6.624.30旨-3.0F3.10-4.0525465t /min: 2.01图1 PEG BPA、PEG-GABA的NHS酯的水解i 1.44Fig.1 Hydrolysis of NHS ester of PEG-BPA and PEG-GABA图2w氨基酸衍生化的PEG对干扰素的修饰结果由图可知,两种PEG酸活性酯的水解动力学常Fig.2 Results of IFN-ar2b modified by PEG derived from数k(动力学方程为前述的ln(1-A/A。)=-kt+a)oramino acid分别为0.0915和0.0416,根据一级反应动力学中1- -IFN-a-2b modified by PEG-BPA-NHS, 2-IFN-a-2b modified by计算半衰期公式可相应得出两种PEG酸的NHSPEG-GABA-NHS; 3- - :IFN~a-2b; M -Marker活化酯在实验条件下的水解半衰期分别为7.6min( PEG-BPA-NHS)和16. 7 min ( PEG-GABA-3结论NHS)。对比国外试剂手册(ShearwaterCorpora-本文以两种wr氨基酸和单甲氧基PEG为主要tion Catalog, 2003; Shearwater Corporation Cata-log,2004)中的数据可知,所制备的PEG-GABA-原料,经连接、纯化和水解等步骤,将w氨基酸通过NHS的反应活性与国外文献报道的第2代修饰剂酰胺键连接到CM-PEG的末端,中间产物经活化SPA-PEG相近(16.5 min)。一般来说,PEG活性后,得到了新的具有较长水解半衰期的第2代PEG酯的反应活性受PEG末端的非醚碳链的长度影修饰剂PEG- BPA-NHS和PEG GABA-NHS(合成响0],非醚碳链变长会使其相应酯的反应活性降低，反应总得率为60%)。两种新的修饰剂在pH 8. 0这从链长较短的PEG-BPA-NHS的水解半衰期比的条件下水解半衰期分别为7.6 min和16. 7 min.PEG-GABA-NHS短可以看出;含有更长碳链的氨与国外第2代修饰剂中SPA-PEG系列的合成方法基酸为原料,其水解半衰期会更长，从而与SPA-相比中国煤化工免了使用强酸强PEG系列中的其他修饰剂具有可比性。碱,YHCNMHG合成所得的新型修饰剂对干扰素rhIFN a-2b2.3修饰活性检验用PEG酰-ar氨基酸的活性酯对目标蛋白干扰的修饰实验证实,其修饰效果与文献中商业化的第2期熊玉春,等:末端连接r氨基酸的聚乙二醇修饰剂的制备185PEG修饰剂相当,可用于对蛋白质或酶的修饰。同tide and protein PEGylation [J]. Advanced Drug DeliveryReviews,2002.54:459-476.时,由于此类修饰剂会在蛋白质分子上连接非天然[4] Bentley MD, Zhao X, Shen x M, eal. Serially hindered氨基酸,所以修饰位点可以很容易地通过氨基酸序poly( ethylene glycol) alkanoic acids and derivatives tbereof列测定而确定,因此,用这类修饰剂进行修饰也可作[P]. US:6495659 ,2002-12-17.为一种探索蛋白质活性与修饰位点之间关系的一-种[5] Miron T. Wilchek M. A sctrphotoerte as for soble手段.and immobilized N-hydroxsuccinimide esters [J]. Anal Bio-chem, 1982.126433-435.[6] Harris J M, Kozlowski A. Poly(ethylene glycol) and related参考文献:polymers monosubtituted with propionie or butanoie acids andfunctional derivatives thereof for biotechnical aplications [P].[1] 胡小鍘,何明磊,谭天伟,等. 羧甲基化单甲氧基聚乙二醇的制US,5672662,1997-09-30.备及其对a干扰素的修饰[].过程工程学报，2003,3(2);[刀] 刘丽军,赵丽纯,朱 迅,等. 聚乙二脖活性瘤对干扰素a毗化146-150.学修饰的初步研究[J].中国生物制品学杂志，2001,14(4);[2] Zalipsky s. Active carbonates of plyllkylene oxides for mofi-210-212.fication of polypides [P]. US:5122614.1992-06-16.3] Roberts M J, Bentley M D, Harris J M. Chemistry for pep-[7] Ge Qingjie,Huang Youmei, Qiu Fengyan,et al. Bifuntional(上接第156页)catalysts for conversion of synthesis gas to dinethyl ether[J]. Appl Catal,1998,167 :23-30.[8] Peng XD, Toseland BA, Tjim PJ A Kinetie understand-ing of chemical asynergy under LPDME condition once through[1]刘殿华,徐 江,张海涛,等.三相搅拌反应釜中合成气直搂合apliationsJ]. Chem Eng Si, 199 54; 2787-2792.成二甲醚[].化工学报,2002 ,53(1),103-106.[9]郭俊旺,牛玉琴,张碧江 浆志床合威气制二甲醚的宏观动力[2] Voss B,Joensen F, Hansen J. Preparation of grade dimethyl学研究[].天然气化工,00025(1);4-7.ether from synthesis gas[P]. WO,9623755,1996.[10] 郭莹,黎汉生,王德峥,等. 合成气一步法制二甲雕反应宏[3]Air Products and Chemicals Inc. Liquid phase dimethyl ether观动力学[].石油化工，2003, 32(6):478-482.demonstration in the laporte altenative fuels development unit[1]张海涛,曹发海,刘殿华. 合成气直搂合成二甲饕与甲醇的热[R]. Aleleomon,enesvanis.[s. n.].2001.力学分析[].华东理工大学学报(自然科学版) ,2001,27(2),[4] Wang Zhiling,Dino Jie, Wang Jinfu,et al. Study on synergy198-201.efee in dimehyl ether synthesis from yngasCJ]. ChineseJ [12] 宋维 端,朱炳辰,骆赞椿.应用SHBWR状态方程计算加压下of Chem Eng,2001,9(4):412-416.甲醇合成的反应热和平街常数[].华东化工学院学报,1981,[5]孙亚明.杜万斗,王乃计. 含氧代用燃料合成技术现状[].媒17(1)11-24.质技术2004.11(6) +56-58.[13]宋维端 ,朱炳辰,王弘轼. C301铜基催化剂甲醇合成反应动力[6]王和平. 合成气一步法制二甲醚工艺及催化剂研究进展[].学:1.本征动力学模型[].化工学报,1988,38(4) 1401-408.工业催化,003.11(5)134-38.中国煤化工MHCNM HG