组合化学与多肽合成

2004年2月.河北工业大学学报February 2004第33卷第1期JOURNAL OF HEBEI UNIVERSITY OF TECHNOLOGYVol.33 No.1文章编号: 1007-2373 (2004) 01-0055-06组合化学与多肽合成马宇辉，赵静波，赵继全，郑辉杰(河北工业大学化工学院，天津300130 )摘要:介绍了组合化学产生的背景和组合化学的定义以及组合库的构建和鉴别方法，并就其在多肽合成方面的应用述以实例，最后对其发展方向作- -展望.关键词:组合化学;快速筛选;多肽库; 功能多肽;多肽合成中图分类号: 0621.3文献标识码: A0引言进入90年代以来，尽管新药研究的投资不断增长，但是新药先导化合物(Lead compounds)出现速度却越来越慢，如何最大限度地筛选各种新化合物及其异构体，即“快速筛选”，从而首先找到具有药效作用的先导化合物，是当今化学正在努力解决的重要课题之- -.建立化合物库进行多模型筛选即组合化学的方法是国外各大医药公司普遍采用的方法.组合化学(Combinatorial chemistry)最早称为同步多重合成(Simulaneous Multiples synthesis)，合成肽组合库(Synthetic peptide combinatorial Library),也称组合合成(Combinatorial syothesis),组合库(Combinatorial Library)和自动合成法(Autosynthesis) 等，60年代初建立的固相多肽合成法为组合化学方法的建立奠定了基础.80年代中期建立的多中心合成法和茶叶袋法中首次引入了肽库的概念,本文将结合功能多肽的筛选着重介绍有关组合化学的基本理论、组合库的合成方法、目标产物的筛选，并就组合化学今后的发展提出自己的观点和意见，以期促进组合化学在我国的推广应用.1组合化学 的基本理论所谓组合化学",就是将诸如氨基酸、核苷酸、有机小分子类的构建单元按某种组合方式连接起来，合成出包含大量化合物的化学库，并从中筛选出具有某种物理、化学或药理活性化合物的一套合成策略和筛选方案.仅仅几年时间，组合化学就发展成具有如下研究新内容的交叉学科: 1)随机肽，蛋白及非天然聚合体化学库; 2) 寡糖及寡糖核苷酸库; 3)小分子有机化合物库: 4) 化学库的设计、构建及自动化合成; 5) 分子标记、分子骨架和构件单元试剂盒; 6)快速及计算机筛选; 7) 化合物库数据处理及软件工具; 8)群集筛选方法的研究; 9)组合化学技术工业.组合化学研究的3个基本阶段为: 1) 分子多样性化学库的合成(包括设计模板分子、研究和优化组合合成方法、选择构建单元、规定化学库的容量，保证化学库的再生，寻求化学库的质量监控方法及优化条件，完成自动化合成等); 2)群集筛选(设定液相或固相筛选方法，即合成产物是挂在树脂上还是切落于溶液中进行筛选.选择筛选模型，包括细胞功能性筛选，受体、抗体,基因表达蛋白筛选，采用的指示方法如染料染色、荧光标记、同位素标记以及自动化筛选等); 3) 化学库解析，译码(即确认活性分子结构，有Houghten的逐位和二元定位理论、亲和选择法、检索库法、编码化学库等).中国煤化工收稿日期: 2003-07-02作者简介:马字辉(1978-)， 女(汉族)， 硕士生.MYHCNMHG5河北工业大学学报2004年第1期2组合库的合成方法.组合化学研究的基本思想是合成分子多样性化学库.每-一个化学库都具有分子的复杂性或称为可变性和多样性、复杂性代表了所有可变的位置;多样性则反映了给定化学库内分子在生物化学性质和化学结构上非类似性，分子间没有简单的定量关系.组合库的方法与传统的合成方法存在显著差异，以往的合成方法，一次只合成一种产物:而组合的方法，同时用n个单元与另-组n'个单元反应，得到所有组合的混合物，即n+n' 个构建单元，产生nxn'个构建单元，产生nxn'个化合物，如图1.A+B-传统➢ABAl+ BAx+ B2A,+ B,组合合成+ AB, (所有可能的组合)nxn'个化合物A.+ B.图1组合合成方法与传统合成方法比较示意图以肽类化合物为例，用20种天然氨基酸为构建单元，二肽便有400 (20) 种组合，三肽有8 000(20)种组合.以此类推，到8肽将有25 600000000 (20)种组合.常见的组合库构建方法有混合-均分法(- -株-肽)，迭代展开法，位置扫描法，光控定位合成法，茶叶袋法等等，现在就多肽合成为例列举几种组合库的构建方法.2.1混合- -均分法(一株-肽)混合-均分法是建立最早，应用最广泛的组合化学方法、“一株 一肽”合成法结合了“混合一均分”合成方法和生物筛选技术特点，建立了Selectide使组合化学技术向前大大推动了一步，成为今天基本方法之一.该法利用树脂做载体，进行随机合成，可以同步合成上百万个多肽分子.首先将19种保护的天然氨基酸(由于Cys易氧化成二硫键，故没用)分别连在树脂上，得到19种在树脂上的氨基酸，混合脱除保护，再分成19份，分别与19种保护氨基的天然氨基酸进行偶联反应，可得19x19种连在树脂上的二肽，如此再进行3次，可合成出19* =2476 009种连在树脂上的侧链保护五肽，脱除侧链保护但不从树脂上切下，可得近2.5百万个连在树脂上的不同肽段组成的肽库.此方法可保证同一树脂上的肽段序列是相同的，即保证了-一个树脂上只有一种肽-一“一株 一肽”,示意图如图2.昆XZXx, XY, xZYX, Yz，YYzx, ZY, zzXXX，XYX,XZXYXX,YYX，YZXzXx，ZYX，ZZxxXY,XYY,XZYYXY,YYY,YZYzxY,ZYY，ZZYxxz，XYZ. XZz|YxZ，YγZ,YZZZxz，ZYZ, zZz图2“一株一肽”合中国煤化工2.2迭代法YHCNMHG用迭代法处理含两个单元的8个三聚物时，先合成两个子库A-X-X和Ar-X-X,选择A;和Ax中哪一组合化学与多肽合成57个性能更优.假设确定A,再固定位置I,合成两个子库ArB-X和A-B-x,检验性能后，假设确定B2,再合成两个子库ArB-C和A-B:C.最后筛选得到最佳产物A-B-C.因此，含8个三聚物的库，需进行3x2个展开步骤，对于含20^ (160 000)个四肽的库，需展开4x20个步骤，如图3所示.A.-x-xA.-B,-CA-X-XA.-B,-C .A)-B.-CA.||BAx-B.-CX-B.-XA.-B2-C,Az{An-B.-CX-B,-X .A1-B.-C2Ax-B2-Cx-x-C,x-x-C;图3“迭代法”合成示意图位置扫描法与迭代法相类似，不同的是，该法从合成产生，即将库分成若干子库,如合成三元混合物，需要制备6个子库，使得每个构建单元占据3个位置中的1个，同时检验6个库中各成员的性能，以确定在每个位置中，哪- -个单元活性最高，如图4所示.Ax-X-X步骤1固定位置1A-B,-C.测生理活性ACiA-B-C步骤2A-x-XA:-B:-CA:-B.-C:保持A在位置1An-B.-xA.-B;-XA-B.-C2固定位置2,测活A.-B.-Cz步骤3.An-B,-XA-B.-C2 .保持B,在位置2A-B.-x固定位置3,测活A.-B.-C图4“位置扫描法”合成示意图2.3光控定位组合库法(Combinatorial libararies by light directed )这是另外一种以固相多肽合成和光刻技术为基础的肽合成法，它是将带有光敏化基团NVOC (Ni-troreratryloxycarbonyl)的氨基酸固定在片状载体上，按照- -定的模式光照，脱出氨基酸N端的光敏保护基团，将载体片浸入同样带有NVOC保护的氨基酸溶液中，载体上脱保护氨基酸与溶液中的氨基酸缩合，反应结束，冲洗载体片上残留氨基酸，再按某种模式光照缩合.可见，载体上产物结构与光刻模式和氨基酸的加入顺序有关，而且采用光控法合成出的肽库体积由光刻分辨度和载体片的尺寸所决定.2.4茶袋法(Tea-bag method)在带微孔的聚乙烯或聚丙烯小袋中，装入固相载体.反应时将数小袋浸入同一种反应器溶剂中，进行脱保护--洗涤一缩合循环的固相接肽反应，反应完成-;中国煤化丁将某些小袋取出投入另一反应器中进行下步接肽反应,最后以每小袋为一进行生物活性筛选TYHCNMHG8河北工业大学学报2004年第1期2.5多针法(Multipin synthesis)聚乙烯针状小棒为固相载体，先在小棒- -端接 上联肽结构，另- 端则固定于板上,每块板可固定几十支平行排列的小棒，注意排列要规则，两针间距离适宜.反应时将此板小棒头浸于相对应滴度槽中进行缩合反应，整个过程采用Merifeld 标准合成方法完成，最后脱去保护基，但不从载体上切下肽链，让肽段悬挂于树脂上可多次重复的进行活性研究.2.6纤维载体法(Synthesis on cellulose)纤维素材料作固相载体，载体表面-0H接上联肽结构后将此种载体圆片装在玻璃柱内，每柱载体片愈多，合成量愈大，将柱排列，每柱合成一种肽类似物，柱愈多产物种类愈多.缩合到各不相同的构件时，每柱单独反应.合成完毕去保护基最后分别裂解，得到制备量的产物.为了进行快速粗筛，又发展了在纤维纸片上列陈式合成法.此法是将预制的活化羧基组分滴加至相互间隔1 cm左右中的“氨基点”上缩合，几小时后再依次洗涤一脱保护- 洗涤- _缩 合等多次接肽循环.3目标产品的筛选组合化学被称为“ 多样性的科学”。如何鉴别具有大量混合的组合库，并对库化合物进行分析和表征，-直是制约组合化学发展重要因素，目前库的分析和表征方法以质谱法21为主，包括电子喷雾离子MS,电子喷雾离子Fourie 变换MS,基体辅助的激光解吸/电子飞行时间MS等技术的运用D,可对固相表面进行非破坏性分析，得到详尽的库信息，以探测库的多样性和复杂性.与其它技术连用，如HPLCMS,键合相毛细管电泳/MS和MS/MS等方法,可对固相库和液相库的多个成分进行分析和表征.大数目和微量制备测试样品是快速筛选技术的关键.以Selectide技术为例，固相筛选主要是依据分子水平的筛选模式，将所合成的固载化学库分子直接与活性蛋白反应，再用蛋白染色或标记的方法将活性株挑选出来进行结构确认.例如，抗原一抗体反应146，蛋白G、MHC-类分子的筛选，凝血酶、因子Xa活性抑制研究，抗菌索受体配基筛选和胰蛋白酶功能研究等，它的特点是:快速，仅数小时即可筛选10'~ 10"树脂球(每- 一个树脂球上负载- -个化合物， 或负载多个化合物).液相筛选是指将合成的分子从树脂载体上切入溶液中进行生物筛选，目前主要采用Houguten 的逐位或二元定位方法和化学库编码方法进行.也可利用自动连续柱色谱法，对肽库进行筛选.将含固定化目标分子的“目标”柱与色谱反相柱相连，肽库中的化合物先入目标库，由于它们和目标分子的相对键合性不同，专- -性键 合的肽从反相柱流出后，被鉴定和测序.此法使筛选速度大为加快.生物活性筛选采用反应株-肽--抗体复合物被第二个带荧光抗体或酶标记,显微镜下对呈阳性的柱与未被染色的非活性柱进行分检，在经Edman降解测定该株上肽的顺序，另一种活检方法是每步合成中，缩合一个氨基酸同时接上-一个结构相关并且光照能释放，可用GC分离鉴定的标记分子，反映完成后与染色受体作用，分离出染色的反应株，用光游离标记物，GC-EI法鉴定每个株上标记物组成.4应用组合化学是--种综合性的跨多领域学科，它可以用在很多科研领域中来提高效率,下面仅就其在多肽合成方面的应用述以实例.4.1茶袋法合成六肽库Houghten用茶袋法合成了一个六肽库，该库由18个分库组成，每个分库又由18组混合肽组成.这样每组的前两个氨基酸是确定的，即分别为18个2-氨基中国煤化XXXX-NH.每组共含有20*个肽片，通过ELISA监测找到活性最高的一F)zXXX肽库,找出活性高于平均值的- -组， 以确立第三个氨基酸O,,依次:TYHCNMHG如此进行4、5次组合化学与多肽合成选代筛选，即可确定活性最高的肽片的氨基酸组成".此法配合电脑“分检”可进一步 提高操作效率,合成中还可将D-型氨基酸组合进肽链，以提供足够量供药理筛选的自由肽间.应用表明，茶袋法对抗原决定簇分析，肽激素分子研究，蛋白质片段构想描述具有重要意义.4.2巨噬细胞病毒免疫区域抗原决定族的分析Frank 将连肽结构HO-CH2CCHL-O- (CH2) -C0-以0.3 umolcm2的取代密度与纤维表面_0H相连，多余-0H用AC20封闭.将第一个氨基酸先接到纸片上，然后用机械手吸管均匀吸保护氨基酸活化酯于相隔1 cm氨基点上进行缩合反应(共布49点)，完成缩合后，再将纸浸泡于溶液中洗涤，乙酰化，脱保护，最后用乙醇洗涤，干燥纸片，如此循环直到接肽完成，去保护后直接进行ELISA活性分析，剪下具有活性的点或采用柱法，将100 个纸片紧排于玻璃柱内，每柱载不同的保护氨基，然后进行常规Merrifield 操作，即得较大量的活性肽段，Frank 用此完成了巨噬细胞病毒(cytmegalovirus, hcnv) 免疫区域抗原决定族的分析[".4.3人血小板纤维蛋白元受体糖蛋白肽库的合成筛选用除了Cys 以外的19种天然氨基酸进行5次“分-混”或缩合反应，Lam 等建立了人血小板纤维蛋白元受体糖蛋白gp I b/Ma肽库β细胞淋巴瘤特异肽库等I0.. 3天内就完成247万多个肽产物的制备,每粒树株脂带有50~ 200 pmol的一- 种肽，进行活性监测时先将受体与碱性磷酸酯或荧光试剂偶联，再与肽库培养.半天内就可以挑出着色的或显荧光(即有活性)的珠子进行氨基酸顺序分析，定出先导物的结构.结果发现YGGFQ、YGGFA及YGGFT3种肽与抗β endorphin单抗有很强的亲合活性，还在另一种筛选中找到23个与stoepavidine结合力很强的含有HPQ片段的五肽.4.4抑制Aβ纤维生成的抗蛋白水解酶的配体合成Lars从D-型氨基酸五肽库中筛选出可以抑制AB纤维生成的抗蛋白水解酶的配体".在近年来研究颇多的老年痴呆病(Alzheimer) 中发现，淀粉样B~肽(AB) 的大量纤维状聚合物在大脑薄壁组织和维管中的沉积是Alzheimer发病原因中关键的一步. 因此如何控制Aβ沉淀是研究的关键. Lars 等人用纤维载体法2合成了五肽库，用活化的FmocF-丙氨酸N, N-二异丙基碳亚胺将纤维膜衍生化.将一种包括B-丙氨基酸二肽的垫片偶联到衍生化的纤维膜上,然后用溶解在N_甲基吡咯丙酮中的Fmoc-保护和五氟苯基活化的氨基酸进行反应合成所需的肽(偶联效率用溴酸兰检测). -个五肽组合化学库理论上应包括所有的2 476 099种肽(不包括半胱氨酸的19种D-氨基酸的组合)用碘标记法筛选出130 321种不同序列.这些氨基酸中有的碱性侧链(h, k, r), 有的有芳香侧链(f，y, w)，有的有非极性侧链，带有酸性侧链的氨基酸不能提高结合力，这说明了电子相互作用(即与LBMP1620的Lys相互作用)对结合并不重要.最后发现KLVFF"可与AB中的相同序列Aβ16 20立体特异性结合，分子模型表明，两种结构相似的序列靠Lys、Leu和苯丙氨酸的羧基相互作用形成非典型的反平行B片层结构.这些由D-_型氨基酸组成的配体不仅能与Aβ结合，而且可以阻止淀粉样纤维生成.5展望组合化学今后将如何发展是许多药物化学家、生物学家和化学家所关注的重要问题，它将直接影响21世纪生命科学领域.组合化学虽然已经取得了很大成就，但它仍旧存在一些有待继续研究的问题: 1)提高合成化合物组合库的分子多样性; 2) 开发与之配合的敏感有效的快速分析和鉴定手段: 3) 与其它关键技术相结合，比如组合化学与计算机化学的结合.另外，多肽组合化学技术的应用首先需要有特别设计的合成策略，即采用怎样的方法方式组建肽库以克服掌握大量单个化合物的困难，获得最有力的发现和进展.在多肽药物开发中应用组合化学技术，药物化学家认为有两方面的前景，一-是作 为寻找肽类药物中国煤化工评价药物发现中设计的合理性.YHCNMHG6(河北工业大学学报2004年第1期多肽组合化学技术用于建立各类肽库分子库从80年代中期的探索至90年代才起步.其定性的报道也是近几年的事.然而它却为快速大量合成生物活性肽类化合物提供了全新的思路.因此，很快成为多肽类新药研究开发中的热点.组合化学具有巨大的发展潜力，随着其在更多化学领域中的渗透，组合化学将会得到更大的发展.参考文献:[1]刘东祥，蒋华良.陈凯先，等.化学库及分子差异性设计研究进展[D]. 化学通报，1998 (2): 34-36.[2] BrummelCL, Loo1N W, ZhouY, er al. 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