聚乙二醇修饰重组人干扰素ω的过程优化

第62卷第10期化工学报 Vol. 62 No.102011年10月 CIESC Journal October 2011 KEECEEEEEEEG研究论文聚乙二醇修饰重组人干扰素的过程优化潘红春1,刘红,程永刚2,彭力2,徐波2,杨红涛2(西南大学药学院,重庆400716;2太极集团西南药业股份有限公司,重庆400038)摘要:采用分子量20000直链单甲氧基PEG琥珀酰亚胺琥珀酸酯(mPEG-SS)对毕赤酵母表达的重组人干扰素(rhIFNw)进行氨基化学修饰,以期获得抗原性降低及稳定性增加的单链PEG修饰产物(peg--rhIFN)。建立了PEG修 rhIFNw饰的反应体系,考察了修饰反应各因素对单修饰产物得率的影响,优化修饰工艺条件为:反应体系起始pH值8.5, rhIFNw/PEG摩尔比1:7, rhIFNw浓度0.75mgml-2,磷酸盐缓冲液浓度50mmol·L-1,于25℃振荡反应4h,用30%冰醋酸终止应.在优化条件下,单链 PEG-rhIFN含量和修饰率分别达到0.25mg·ml-和34.63%。纯化后的单链 PEG-rhIFNw具有典型PEG修饰蛋白的特性,体外抗病毒活性保留了天然 rhIFNo抗病毒活性的15%。关键词:重组人干扰素;聚乙二醇;过程优化;抗病毒活性o:10.3969/.issn.0438-1157.2011.10.028中图分类号:TQ031.2;TQ021.8文献标志码:A文章编号:0438-1157(2011)10-2876-09 Processing parameters optimization of PEGylation of recombinant human interferon omega PAN Hongchun'', LIU Hong', CHENG Yonggang'2, PENG Li,xubo2, YANG Hongtao2 School of Pharmaceutical Sciences, Southwest University, Chongqing 400716, China; 2 Southwest Pharmaceuticals Company Limited Liability, Taiji Group, Chongqing 400038, China) Abstract: In order to reduce the antigenicity and enhance the stability of the recombinant human interferon omega (rhIFNw) expressed in Pichia pastoris, the amino group modification of rhIFNw with mono- methoxy polyethylene glycol succinimidyl succinate(mpeg-ss,00) was investigated. It was found that the optimized reaction conditions for the highest modification yield of mono PEG-rhIFNw were as follows: in 50 mmol.L-I and pH 8. 5 phosphate buffer, concentration of rhIFNw 0. 75 mg.ml-I, molar ratio of rhIFNw to PEG 1 7, and reaction time4 h at 25C. Under the optimized conditions, the content and modification yield of mono PEG-rhIFNw- reached.25mg.ml-and34.3%, respectively.he purified PEG-rhIFNo had the characteristics of typical PEGylated protein. The experiments showed that the antiviral activity of prepared PEG-rhIFNw could retain about 15% of the antiviral activity of the native rhIFNw Key words: recombinant human interferon omega(rhIFNw); PEGylation; process optimization; antiviral activity2011-01-07收到初稿,2011-05-29收到修改稿 Received date: 2011-01-07.联系人:刘红。第一作者:潘红春(1966一),女博士,教 corresponding author: liu Hong, Ihphch@126.com授级高级工程师第10期潘红春等:聚乙二醇修饰重组人干扰素的过程优化2877二极管阵列检测器, SHIMADZU2410紫外分光引言光度计, Phast-System-全自动水平电泳仪,Bio重组人干扰素(recombinant human inter--Rad680型酶标仪。 feron omega, rhIFNw)是一种多功能细胞因子, rhIFNo原液,由毕赤酵母表达,纯度大于它可在细胞表面与特殊受体结合而发挥抗病毒、抗98%,抗病毒活性1.81×10U·m1-1,比活性细胞增殖和免疫调节作用尤其对肝炎病8.82×107IU·(mg蛋白)1,西南药业股份有限毒、SARA病毒、多种肿瘤细胞有很强的抑制公司提供;单甲氧基聚乙二醇琥珀酸琥珀酰亚胺酯作用,临床上有望开发成一种有效的抗病毒抗肿瘤(mPEG-SS),直链,分子量20000士300,纯度药物。然而,rhFN依然存在天然蛋白药物的体98%, SigmaPEG-r公司出品单链原液,、。,内半衰期短、免疫原性强等诸多不足,使其应用开纯度大于98%,抗病毒活性2.79×10iu·ml-,发速度受限。目前,有关克服 rhIFNw局限性的研比活性1.51×107IU·(mg蛋白)-1,本所自制;究报道较少,仅有美国 Intarcia Therapeutics公司 rhIFNw标准品,CHO表达,购于WHO,编号为利用 DUROS微渗透泵技术实现了 rhIFNw的皮94/754,活性单位20000I·安瓿1下脉冲缓释给药1.2 rhIFN的PEG修饰和纯化聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)化学将适量纯度98% rhIFNw原液加入到一定pH修饰技术已成为改善蛋白质、多肽、抗体、值和浓度的磷酸缓冲液中,使 rhIFNw达到需要的基因治疗等药物临床疗效的重要手段,在提高药浓度,按照预先确定的rhIFNw/E摩尔比加入物稳定性、延长半衰期、降低免疫原性、提高药物PEG,混合均匀后于一定温度下、200rmin振水溶性等方面具有广阔的应用前景。迄今,至少已荡反应确定时间,然后加入适量30%冰醋酸溶液有8种PEG修饰的蛋白和多肽类药物被批准应用终止反应。利用 Sepharose离子交换层析和 Super-于临床疾病治疗,且有更多正在经历临床实验。dexG凝胶过滤层析组合,先除去 rhIFNoo,再除PEG修饰蛋白分子是一个极其复杂的过程,修饰去多链PE- -rhIFNw副产物。效果受到诸多因素的影响,如蛋白质结构、修饰方1.3PEG修饰 rhIFNo过程中pH值变化自动监式、PEG分子结构、分子量大小、修饰条件等。测和控制近年来,PEG修饰技术呈现出一些新趋势L10,已将pH电极置入放大反应体系中,用能自动监开发出许多针对某些氨基酸侧链或末端氨基进行选测和控制pH值的发酵控制系统自动监测反应体系择性修饰的修饰剂。pH值变化,从而获得PEG修饰 rhIFNw过程的本文作者针对 rhIFNw蛋白分子中游离赖氨酸pH值变化曲线。通过该控制系统,用酸碱溶液控侧链E氨基和N末端氨基,用分子量2000的直制反应体系pH值在需要范围内,以促进PEG化链单甲氧PEG琥珀酰亚胺琥珀酸酯(monome学修饰反应进行 thoxy polyethylene glycol succinimidyl succinate1.4peg- -rhIFNco含量测定mPEG-SS)对rhIFNw分子中的游离氨基进行选择采用RPHPLC法同时测定反应混合液中单链性化学修饰,以期获得高单链PEG修饰率和少位 PEG-rhIFNw和残留rhIF含量。色谱柱为Wa置异构体。通过PEG修饰条件优化、分离纯化、ters公司 Symmetry300m4反相柱(250mm×结构表征、位置异构体、理化性质等研究,发现纯4.6mm,30nm,5um),流动相A为水:TFA=化的单链 PEG-rhIFNo仅含2种位置异构体。本990:10(pH2.2),流动相B为100%乙氰,流速文将着重报道PEG修 rhIFNw饰过程中各修饰条为1.0ml·min-1。线性梯度洗脱和等度洗脱相结件优化的研究结果以及单链EG化 rhIFN合,流动相用前均经0.45m尼龙膜过滤、脱气,(peg--rhIFNw)的体外抗病毒活性。检测波长280nm,柱温30℃,每次进样30μl1.5PEg修饰率的计算1实验根据反应混合液中 rhIFNw残留量和反应初始1.1仪器与试剂体系 rhIFNw含量,计算总pg- -rhIFNw修饰率, Waters2695高效液相色谱仪, Waters2996其中包括单链PEG修饰和多链PEG修饰产物。计2878化工学报第62卷算公式为1反应体系残留rhN浓度总PEG修饰率换算后反应体系初始 thFNw浓度100% mPEG-O-C-H2C-CH2-C-O-N+(1 mPEG-succinimidyl snccinate根据单链Pg- -rhIFNw含量和反应初始体系 incubate rhIFNw含量,计算单链PE- -rhIFNo修饰率,计算公式为单链PEG修饰率反应体系单链 PEG-rhIFN浓度 mPEG-o-c-H2C-CH2-C-HN-mIFNoo+OH-N换算后反应体系初始 rhIFN浓度 PEGylated rIFNoo100%(2)图1PEG修 rhIFNw饰的化学反应式1.6抗病毒活性测定 Fig. 1 Reaction scheme of synthesis of PEGylated参照2010年版中国药典三部附录XC“扰 recombinant human interferon omega (rhIFNw)素生物学活性测定”中WISH细胞法测定,结果 (A linear polyethylene glycol (PEG)-succinimidyl用IFN标准品进行校正。 succinate yields an amide linkage with or c-amino group of rhIFN)2结果与讨论确定单链 PEG-rhIFNw仅包含2个位置异构体,2.1mpeg-ss选择性修饰 rhIFNo的a或氨基推断单链P-rhIFNw-的修饰位点为Lys(33)或人干扰素级结构中赖氨酸含量较少,仅Lys(167)和Lys(46)或Lys(52)或Lys(152)第33、46、52、134、136、137、152和16位为2.2pH值对PG修饰rhi的影响赖氨酸,且第3位半胱氨酸(Cys)与第101位用25mmol·l-na2hpo4-kH2PO4缓冲液,Cys以及第31位Cys与第141位Cys残基结合形调节反应体系宽起始pH值4.0~10.0及窄起始成2个二硫键,因此, hIFN分子的N末端pH值7.30~8.70进行实验,维持反应体系a氨基及部分赖氨酸侧链e氨基不易暴露用 rhIFNw浓度0.5mg·ml-1, rhIFNw/PEG摩尔比 mPEG-SS针对游离氨基进行选择性化学修饰,有1:7,温度25℃,摇床转速200r·min-1,总体望减少单链 PEG-rhIFNw位置异构体的形成。其积0.5ml。反应4h后各加20μ130%冰醋酸溶液化学反应式见图1.通过对纯化的单链PE结束反应,用HPLC测定单链 PEG-rhIFNw含量, rhIFN进行毛细管电泳、等电点和肽图分析,可结果见图20.160.1270.050.00.1416000.1201140.0管150.00.1000.100.08百840.020.00.09300.00.0410.020.00.020.0806789107.37.57.77.98.18.38.58.00 initial value initial pH value(a) (b)图2起始pH值对单链 PEG-rhIFNw含量的影响 Fig.2 Influences of initial pH value on PEG-rhIFNo content第10期潘红春等:聚乙二醇修饰重组人干扰索的过程优化2879图2(a)结果表明,反应体系起始pH值低于饰率和浓度,并可使 rhIFN得到充分利用,但因6.0时,修饰rh的反应发生,起始PEG修饰剂价格PEG-rhIFNw昂贵,为主要成本pH值8.0~9.0时,有利于PEG修饰 rhIFNw,来源,故PEG修饰工艺研究过程更应重点考虑单链PEg -rhIFNw-浓度达到0.11~0.12mgPg修饰剂的充分利用此外,SDS凝胶电泳图ml-1,总修饰率为47%~50%,单链peg谱显示,/PEG摩尔比达到1:10,多链 rhIFNw修饰率最高可达25.17%。图2(b)结果表PEG-rhIFNw条带显著增强因此,综合考虑修饰明,PEG修饰rh反应进行的最适合起始pH率、修饰剂成本以及分离纯化成本,选择 rhIFNw/值为8.34,此时,单链PEG-rhIFNw浓度为0.112PEG摩尔比为1:5进行下面的研究。mgml-,总修饰率为55.7%,单链PEG2.4反应时间对PEG修饰 rhIFNo的影响 rhIFNw修饰率达23.40%。因此,控制反应体系控制起始pH8.3, rhIFNw/PEG摩尔比1:的起始pH值8.0~8.5为宜。反应pH值是PEG5,其他反应条件不变,研究反应时间对PEG修饰化蛋白的最重要影响因素之一,除影响修饰反应速 rhIFNo的影响。分别于反应1、2、3、4和6h时率外(12,还影响修饰位点的专一性,导致单链取样测定单链PE -rhIFNo-的含量,结果见图4PEG蛋白位置异构体比例的变化13随着反应时间延长,单链 PEG-rhIFNw含量逐渐2.3 rhIFNo/Pg摩尔比对PEG修饰的影响增加;当反应时间达到4h时,单链peg- -rhIFNo控制反应体系 rhIFNw/PEG摩尔比为1:1、含量达到最高为0.100mgml,单链peG1:5、1:10、1:15和1:20,起始pH为8.3, rhIFNo修饰率和总修饰率分别为20.77%和其他反应条件同上,结果示于图3,由图可知,35.80%。因此,PEG修饰 rhIFNw的反应时间以 rhIFN/PEG摩尔比为1:15时,反应液中单链4h为宜。peg G-rhIFNw-含量最高达0.173mgml-1,单链2磷酸缓冲液浓度对G修饰的影响peg- -rhIFNo修饰率最高达35.94%; rhIFNw/控制起始pH8.3, rhIFNw/PEG摩尔比1:PEG摩尔比为1:20时,单链PEG--ThIFNo修饰5,反应时间4h,其他反应条件不变,研究磷酸率下降,而总修饰率达到最大为90.8%。缓冲液浓度对PEG修饰 rhIFNw的影响。分别控PEG修饰蛋白药物过程中,蛋白/PEG摩尔比制磷酸缓冲液浓度为12.5、25、50、100和200的选择因蛋白种类、PEG种类、修饰位点等而各mmoll,测定单链 PEG-rhIFNw含量,结果不同115,范围在(1:1)~(1:250)。高见图5。随着磷酸缓冲液浓度的增加,单链PEG rhIFNw/peg摩尔比虽有高单链eg--rhIFNw修 rhIFNw含量呈逐渐降低趋势,但磷酸缓冲液浓度0.18不宜太低,以25~50mmol·L-为宜。因此,选100.00.183800.1690.036.0T0.1480.00.16T34.00.127000.140.1060.0巴32.00.1230.0,0.0850.0801028.00.0640.00.100.0426030.00.080.0220.024.010.00.061:11:51:101:152201:151:20 mhIFNo/PEG molar ratio0.0420.034图3 rhIFNw/pG摩尔比对peg- rhIFNw含量的影响 reaction time/h Fig.3 Influences of rhIFN/PEG molar ratio图4反应时间对 PEG-rhIFNw含量的影响 on PEG-rhIFNo content Fig.4 Influences of reaction time on PEG-rhIFNw content2880化工学报第62卷0.1560.00.4580.00.4070.00.1455.00.35600.00.1350.0E03050.00.250.1240.045.00.200.1130.00.1540.020.00.100.100.0510.00.0935.010.40.71.01.31.61.9104070100130160190 mhIFNe concentration/mgml' buffer concentration/mmol-L-图6 rhIFNw浓度对eg -rhIFNw-含量的影响图5缓冲液浓度对 PEG-rhIFNw含量的影响 Fig.6 Influences of rhIFNoo concentration Fig.5 Influences of buffer concentration on PEG-rhIFNo content on PEG-rhIFNo contenth,反应总体积0.5ml,反应振荡转速200r择磷酸缓冲液浓度25mmol·L进行下面的min-1,反应终止液30%冰醋酸20μl。确定表1研究。所示的各因素和水平,选用表2所示的L9(34)2.6 rhIFNo浓度对PEG修饰 rhIFNo的影响正交表安排实验,共进行9组实验,每组3个平行控制磷酸缓冲液浓度25mmol·L-1,起始样,实验结果取其平均值,以单链PEG- -ThIFNwpH8.3, rhIFN/PEG摩尔比1:5,反应时间4和 rhIFNw残留含量为测定指标,以单链EGh,其他反应条件不变,研究 rhIFNw浓度对 PEG rhIFNw修饰率为评价指标。正交实验结果见表2修饰 rhIFNw的影响。分别控制 rhIFNw浓度为表1正交实验各因素和水平0.125、0.25、0.5、1和2mg·ml-1,测定单链 Table Factor and level of orthogonal designeg- -rhIFNw含量,结果见图6.随着 rhIFNw浓 Initial pH Molar ratio rhIFNo度的增加,体系中PEG浓度也按摩尔比1:5同比 Level value of rhIFNo concentration- ter.增加,致使反应体系中单链PEG -rhIFNw和多链peg- -rhIFN均随 rhIFNw浓度增加而增加。当0.500.03 rhIFNw浓度为2mg·ml时,体系中单链PEG80.750.05 rhIFNw浓度可达0.422mgml-1.修饰率计算结38.51:71.000.07果显示,单链 PEG-rhIFNo修饰率随 rhIFNo浓度直观分析上述实验结果,各因素和水平对应的增加的变化幅度不大,而总修饰率呈现先逐渐增K、k和极差R值见表2。比较各因素极差R值大加,后降低并趋于稳定的变化趋势,当 rhIFNw浓小,确定各因素主次顺序为B>C>D>A.因素A度为0.5mgm时,总修饰率为最高达对单链PE- -rhIFNo修饰率影响小,且适当提高74.24%因此,综合考虑,选择rhIFNw浓度为体系pH值有利于加快反应速度,选取A3;因素0.5mg·ml较适宜。C的水平2和水平3差别不大,且 rhIFNw浓度越2.7Peg修饰 rhIFN的正交实验高副产物多链 PEG-rhIFN生成越多,选取C2;根据上述各单因素对PEG修饰的影响程度,对于因素B,虽然 rhIFN/PEG摩尔比1:7可能选取起始pH值、 hIFNw/PEG摩尔比、磷酸缓冲偏小,但综合考虑PEG修饰剂的成本和利用率,液浓度和反应体系 rhIFNo浓度4个因素进行正交不再进行更大PEG含量的实验研究,选取B3确实验,以考察各因素相互变化的综合效果。其他实定优化PEG修饰 rhIFNw的工艺条件验条件分别为:控制反应温度25℃,反应时间4为B3C2D2A3第10期潘红春等:聚乙二醇修饰重组人干扰素的过程优化2881表2L(34)正交实验设计与结果表3验证实验结果 Table 2 Arrangement and results of L,(3) Table 3 Results of verification experiment orthogonal experiment by HPLC determination PEGylation PEG-rhIFNw PEGylation rate/% Factor Experiment Experiment rate of mono- content mono-PEG-(mono+poly) No. No. PEG-rhIFNoP EG-rhIFNo A C D/% optimized experiment0.4634.1762.031111114.75 No.3 experiment0.22431.0459.382312231.22132331223133.01修饰 rhIFNw均可获得良好的修饰效果,前者略优2323131216.79于后者,前者可使反应液中单链PEG-rhIFNw含4567823312312327.082330.73量达到0.246mg·ml-,单链Eg -rhIFNw-修饰22.12率达到34.17%,总修饰率为62.03%。正交实验20.44优化的PEG修饰条件可用于后续研究和放大研究。9332.182.8温度对PEG修饰的影响K178.9853.6665.9274.01K274.6078.7480.1984.07在上述优化实验条件下,选择5℃、25℃和K374.7495.9282.2170.2440℃进行PEG修饰 rhIFNw的温度实验,反应中kk处26.32717.88721.97324.6定时取样测定,结果见图8.温度显著影响PEG24.86726.24726.73028.02324.91331.97327.40323.4n修饰 rhIFNw的速率,温度越高反应速度越快。R1.46014.0865.4304.615℃下,3h前单链 PEG-rhIFNw含量随反应时间延长而快速增加,3h后则缓慢增加;3h和24h确定PEG修 rhIFNw饰反应体系的优化条件单链eg -rhIFNw-的含量分别为0.157mgml-为:起始pH值8.5, rhIFNw/PG摩尔比1:7,和0.224mgml1,修饰率分别为21.81%和 rhIFNw浓度0.75mg·m-1,磷酸缓冲液浓度5031.06%。25℃和40℃下,3~4h时单链PEGmmolL,温度25℃,反应时间4h,反应总体 rhIFNo含量达到最大,随后呈缓慢降低趋势;单积0.5ml,反应振荡转速200r·min-,30%冰链eg -rhIFNw含量最大值分别为0.227mg醋酸反应终止液20μlml-(4h)和0.260mg·ml(3h),修饰率最大用正交实验优化的PEG修 hIFNw饰反应条值分别为31.56%(4)和36.17%(3h)件和正交实验结果最好的3号实验组条件进行验证SDS凝胶电泳分析结果表明,温度越高反应实验,各组实验3个平行样,单链 PEG-ThIFNw速度越快,单链PEG- -rhIFNw含量越高,然而多含量和修饰率以及总修饰率结果见表3,DS凝胶聚 PEG-rhIFNw副产物也会随之增加,同时蛋白电泳图谱见图7。在优化和3号实验条件下,PEG药物也会失去更多生物活性,甚至使目标产物失去 marker 20.30 poly-PEG-thIFNe0.2540℃830×103620×10 mono-PEG-thIFNo25℃E0.20475×10380.155℃32.5×1030.10250×103 rhIFNe0.0516.5×100图7验证实验 SDS-PAGE分析 reaction time/ Fig. 7 SDS-PAGE analysis of verification experiment图8温度对 PEG-rhIFNo含量的影响 1-optimized experiment; 2-No. 3 experiment Fig. 8 Influences of temperature on PEG-rhIFNo content2882化工学报第62卷应用价值。 rhIFNw的热稳定性研究结果表明放大实验,考察修饰工艺的可放大性,便于纯化工40℃下热稳定性较差,25℃下热稳定性相对较好,艺、质控方法和质量标准、单链PE-rhIFNw-特低温下热稳定性最好。综合考虑PEG修饰反应速性等研究工作的开展。按每批100 mg PEG修饰剂度、 rhIFNw热稳定性、大生产可操作性等因素,进行0801、0802和0803三批放大实验研究。表4选择PEG修 rhIFNw饰的适宜温度为25℃结果表明,获得的优化修饰工艺条件具有很好的稳2.9peg修饰mn反应过程的pH变化和控制定性和可操作性。三批放大实验的平均单链PEGEG修 rhIFNw饰会使反应体系的pH降低 rhIFN含量、单链peg- -rhIFNo修饰率和总修饰用全自动发酵罐pH自动控制系统监测PG修饰率分别为0.25mg·ml-1、34.63%和69.20%。 rhIFNw反应过程的体系pH发现,起始pH8.5的张琛等16利用单甲氧基聚乙二醇(mPEG)化学修饰反应体系,反应1h后体系pH降至8.22h修饰中性蛋白酶的总修饰率为41.7%,杨宇峰后体系pH稳定至8.1左右结合图4分析尽管等用单甲氧基聚乙二醇丙酸琥珀酰亚胺(SPA-反应体系pH降低很快,但修饰反应仍在继续,单mPEG20000)修饰重组人干扰素a1b的单点修饰链pg -rhIFNo-浓度和修饰率逐渐增加,直到4h率为33%。因此,本研究结果已达到并超过文献时达到最高。报道的结果。针对上述问题,利用该pH自动控制流加酸碱表4放大实验结果体系,开展PEG修饰 rhIFNw反应体系pH的过 Table 4 Results of amplification experiments程控制研究,控制反应过程体系pH维持8.5 PEG-rhIFNw PEGylation rate/%(8.4~8.6),每半小时取样测定,结果见图9.1 Experiment content mono-PEG No poly)-h内单链PEG -rhIFNw含量达最大,随后呈逐渐降 /mg. ml-1 rhIFNos G-rhIFNuo低趋势;SDS凝胶电泳分析结果显示,1h后多链08010.25208020.2350435.069.1532.670.02pg -rhIFNw-呈逐渐增多趋势08030.26136.2568.440.180.162.11peg -rhIFNo-的抗病毒活性测定0801、0802和0803三批g- -rhIFN原0.14液的抗病毒活性和蛋白浓度,计算出比活和比活残80.12留率,见表5。 PEG-rhIFNw原液的比活均大于0.101.00×107I·(mg蛋白)-1,与 rhIFNw的比活8.82×107IU·(mg蛋白)-比较,peg--rhIFN0.08的比活有较大幅度降低,约保留 rhIFNw比活的06051.01.5202.53.03.54.015%左右。PEG修饰蛋白主要考虑修饰物在体内 reaction time/h外残留生物活性和肾脏清除率两个因素,佩乐能图9控制ph8.5时 PEG-rhIFN含量的变化 Fig.9 Change of PEG-rhIFNw, content at pH 8.5表5peg -rhIFN-原液的蛋白质含量、抗病毒活性和比活 Table 5 Protein concentration, antiviral and实验结果表明,控制反应过程体系pH8.5有 specific activities of PEG-rhIFNo利于修饰反应启动,但不利于单链EG- -rhIFNo Antiviral Protein Specific Specific稳定,有助于多链 PEG-rhIFNw生成。有关反应 Batch No sctivity concentration residue activitypH值过程的研究还需要更加深入细致,但图9结 /IU.ml-1 /ugml-1 protein level@/%果已预示,要获得更高单链PEG- rhIFN含量和08012.79×1061851.51×10717.12修饰率,可控制反应体系略低pH或分阶段控制不08022.37×101731.37×10715.53同pH,同时,反应体系放大时应加强反应pH值08032.82×101891.49×10716.84的过程控制。 Specifi ctivit (mg protein )- antivial activity (IU.ml-1)/protein concentration( ml-1), Specific activity2.10g修饰 rhIFNo的放大实验 residue level( % specific activity of PEG-rhIFNo/specific activity对优化和验证的PEG修饰 rhIFN工艺进行 of rhIFNu100%第10期潘红春等:聚乙二醇修饰重组人干扰素的过程优化2883(Eg-FNa-2b,12000直链)和派罗欣(EG proteins at consistent rate continuously for 3 to 12 montlFNa-2a,40000支链)上市以来取得的喜人临床]. Journal of Diabetes Science and Technology, 2008.2(3):461-467应用效果,说明修饰物体外生物活性的保留程度并 [6] Jevsevar S, Kunstelj M, Porekar V G. PEGylation of不与体内疗效有直接的对应关系,还与肾脏清隙率 therapeutic proteins [J]. Biotechnology Journal, 2010,5有关。佩乐能和派罗欣的体外抗病毒活性仅分别保(1):113-128留天然蛋白的28%8和7% [7] Pasut G, Veronese M. PEGylation for improving the Today3结论 effectieness of therapeutic biomolecules [ Drugs Too(Barc),2009,45(9):687-695针对 rhIFNw的赖氨酸氨基和N末端氨基,8]luy Harding, Turner, Smith, Athwal Grossmann J G, Davis K G, Rowe A J. Effect of PEGylation用直链琥珀酸琥珀酰亚胺酯类mPEG进行选择性 on the solution conformation of antibody fragments [J].化学修饰。研究了反应体系起始pH值、 rhIFNo/ Journal of Pharmaceutical Sciences, 2008, 97():PEG摩尔 rhIFNw比、浓度、缓冲液浓度、温度等2062-2079对PEG修饰 rhIFNw的影响,并用通过正交实验 [9] Eto Y, Yoshioka Y, Ishida T, Yao X, Morishige T, Narimatsu S, Mizuguchi H. Mukai Y, Okada N.Kiwada优化了PEG修饰 rhIFNo过程的反应条件,通过 H, Nakagawa S. Optimized PEGylated adenovirus vector因素实验和正交实验优化了PEG修 rhIFNo饰的 reduces the anti-vector humoral immune response against条件,控制反应体系起始pH值8.5、 rhIFNo/ adenovirus and induces a therapeutic effect againstPEG摩尔比1:7、 rhIFNw浓度0.75mg·ml-1和 metastatic lung cancer [] Biological Pharmaceutical磷酸缓冲液浓度50mmol·L-1,于25℃振荡反应 Bulletin,210,33(9):1540-15444h,用30%冰醋酸终止反应,可使反应体系中单0hu, Duppatla Harth, Schmitz Sebald.site specific PEGylation of bone morphogenetic protein-2链PEg -rhIFNw含量、单链PE- -rhIFNo修饰率 cysteine analogues [] Bioconjugate Chemistry, 2010, 21和总修饰率分别达到0.25mg·ml、34.63%和(10):1762-177269.20%纯化后的单链grh具有典型[1dolfgr,fruhbeisb,69J209PEGrhIN1《AdGR,ErdhdsB,HmnRKuJmr1,Maurerkalsner,maurerPEG修饰蛋白的特性,体外抗病毒活性大幅降低, Fogy I, Ostermann E. Patzelt E, Schwendenwein R, Sommergruber W, Zophel A. Human interferon omega 1:保留了天然 rhIFNw抗病毒活性的15% isolation of the gene. expression in Chinese hamster ovary cells and characterization of the recombinant protein [J]. 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Expert Opinion on Drug(6):615-618 Delivery,2008,5(4):371-383信息与交流2012年《聚氨酯工业》征订启事(邮发代号28-344)《聚氨酯工业》创刊于1986年,由中国聚氨酯工业协会和江苏省化工研究所有限公司主办,国内唯一公开发行的聚氨酯行业专业性科技刊物,现已成为中国科技核心期刊和中文核心期刊。被美国化学文摘(A)和国内多家期刊数据库收录。国际标准连续出版物刊号:1SSN1005-1902国内统一连续出版物刊号:CN32-1275/TQ《聚氨酯工业》主要报道聚氨酯制品及其原料等方面的科技成果与发展动态,以刊登行业专题综述、研究报告、生产应用和技术交流、分析测试方法以及生产设备技术进展为主,同时还刊登国内外聚氨酯技术及行业动态。适合涉及高分子合成材料特别是聚氨酯材料研制、应用及管理的科技人员阅读,创刊以来,受到国内外聚氨酯行业专家学者、企事业单位、生产技术人员以及高等院校的高度重视和一致好评,是从事聚氨酯行业人士的必备刊物。位、氨酯工业》为双月刊,全年订价80元,邮发代号28-344订阅者也可通过以下单位订阅:《聚氨酯工业》发行部:南京市北京西路72号邮政编码:210024电话:025-83755190,85664648全国非邮发报刊联合征订:天津市大寺泉北里别墅17号邮政编码:300385;电话:022-23962479,23973378中国化工信息中心期刊图书联合征订部:北京安外小关街53号,邮政编码:100029电话:010-64444115,64444113;如需开具正式发票,请另加4元邮寄费,用于挂号邮寄发票。为庆祝《聚氨酯工业》创刊二十周年,本刊隆重推出《聚氨酯工业》二十周年(1986~2006)期刊合集(DVD光盘),欢迎致电本刊发行部垂询。欢迎订阅!欢迎投稿!欢迎刊登广告!通过本刊发行部订阅办法:1.银行汇款开户行:中国工商银行南京市草场门支行账号:4301016309001017389户名:江苏省化工研究所有限公司2.邮局汇款地址:南京市北京西路72号邮编:210024收款人:《聚氨酯工业》编辑部