一株乙醇利用菌的分离及其在乙醇含量测定中的应用

用与环境生物学报2009,15(4x59-5622009-08-25Chin J Appl Environ Bio/=/SSN 1006-687XDOⅠ:10.3724SPJ.1145.200900559株乙醇利用菌的分离及其在乙醇含量测定中的应用陈亮郑军张益霞赵翠翠何雨原温广明杨素萍赵艮贵山西大学生物技术研究所化学生物学与分子工程教育部重点实验室太原030006摘要从山西清徐农用沼气池中分离得到一株能以乙醇为唯一碳源和能源生长的菌株ME45,通过生理生化特征及16 S rDNA序列分析,将ME45鉴定为嗜有机甲基杆菌 Methylobacterium organophiliun).依据ME45能在有氧条件下利用乙醇的特性,因此以固定化细胞和溶氧仪组成测定系统测定了不同含量乙醇的响应时间以及溶氧变化与乙醇含量的关系结果表明,乙醇含量在0.02%~-2%(W∽)范围内,响应时间小于25min,溶氧消耗量同乙醇含量呈函数关系,拟合系数(R)为09947.干扰实验结果表明,该测定体系具有较强的选择性,待测乙醇样品中其它醇类物质含量不高于乙醇含量5倍对乙醇测定无干扰.以95%乙醇为样品进行多次测定,测定平均值为918%,RSD为3.5%,表明该反应体系重现性良好.本研究为进一步研究乙醇微生物传感器奠定了基础.图7表1参15关键词乙醇;嗜有机甲基杆菌;测定;电化学CLC Q939,9Isolation of An ethanol-utilizing strain and Its applicationin determination of ethanolCHEN Liang, ZHENG Jun, ZHANG Yixia, ZHAO Cuicui, HE Yuyuan, WEN Guangming,YANG Suping ZHAO(Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering of Ministry of Education, Institute of Biotechnology, Shanxi University. Taiyuan 030006, China)Abstract a bacterial strain ME45 which uses ethanol as the sole carbon source for growth was isolated from a family biogasdigester in Qingxu of Shanxi Province, China. Based on the physiological characteristics and 16S rDNA sequence analysis,strain ME45 was identified as Methylobacterium organophilium. Response time and the relationship between consumptionof dissolved oxygen and different ethanol contents were studied with PVA-H, BO, immobilized cell of ME45 usingelectrochemical method. It was shown that the response time of the ethanol detection system was about 25 min for 0.02%-2%(/n)ethanol, the dissolved O, consumption increased with the increase in ethanol content, demonstrating a correlationalrelationship, with the correlation coefficient 0.994 7. Furthermore, the interference test and the detection of ethanol sample bothobtained satisfactory results. This work highlights the potential of this bacterium for monitoring ethanol, Fig 7, Tab l, Ref 15Keywords ethanol; Methylobacterium organophilium; determination; electrochemistryCLC Q9399乙醇俗称酒精,是无色透明、易挥发和易燃烧的液体,析方法的报道,但仍处于实验室硏究阶段氐.因此,寻找简是重要的有机化工基础原料,广泛应用于化学工业、医疗便、快速、准确和应用广泛的乙醇分析方法倍受重视卫生及工业合成等各领域.随着矿物能源的大量开采和消上世纪80年代已有微生物法测定醇类物质的报道,基耗,乙醇作为化石能源替代品将发挥重要作用叫因此,在酿本上都以醇脱氢酶和微生物细胞作为分子识别的元件7,酒、制药、发酵和合成工业产品、化妆品等工业应用领域以从这些研究报道的结果来看,都存在寿命短、选择性和稳定及环境保护工作中准确、快速地检测乙醇含量具有重要的意性差等缺点,仍处于研究阶段,尚未达到应用水平我国目前义乙醇测定的常用方法主要包括比重法、比色法、气相色谱在这方面研究较少,仅有孙裕生等报道了一种乙醇细菌电极法和液相色谱法比重法操作简便,可用于高含量乙醇测的制备,制备简便,并初步用于样品检测,但检出限和检测范定,但对乙醇测定特异性差叫比色法,如重铬酸钾比色法和围无法满足乙醇测定发展的要求,且测量过程中易受其它醇碘量法,显色缓慢且不稳定,受多种因素干扰,操作较为繁类物质干扰咧;而且所用菌株尚未明确鉴定,其代谢机理也琐色谱法能检测微量乙醇,精密度和准确性很高,但仪器昂不甚清楚.目前,国内外微生物法测定乙醇的报道较少,而且贵、操作和维护繁琐.而且色谱法和比色法也无法进行户外检测.另外,还有红外光谱、荧光和激光拉曼光谱等乙醇分多处于实验室研究阶段.因此,深入开发可适用于乙醇检测的微生物资源并应用于乙醇含量的测定具有重要的意义.我们从山西清徐农用沼气池中分离得到一株以乙醇为唯一碳源收稿日期:2008-06-02接受日期:2008-09-12生长的菌株,依据其生理生化特性和16 S rDNA序列分析,该国家自然科学基金重点项目(No.50534100资助 Supported by the Key菌株被鉴定为甲基杆菌 Methylobacterium organophiliun),并Project of the National Natural Science Foundation of China*通讯作者Correspondingauthor(E-mai:chungui@sxu.edu.cn)利用电化学方法,在微生物作为识别元件的测定体系中,初560应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Bio15卷步研究了不同含量乙醇对溶氧的响应时间以及溶氧变化与仪(CI-6542, Pasco Scientific,USA)检测体系溶氧变化,记录乙醇含量的关系,以期为乙醇微生物传感器的研制提供思路溶氧值.和材料材料与方法11材料11.1样品来源微生物分离的水样采集于山西清徐农用沼气池1.1.2培养基①液体培养基:每升含KH2PO40.5g,Na, HPO, 0.5 g, NaCI 0. 4 g, KNO, 1.0g, NH,CI 0.5 gMgSO4 7H, o 1.0 g, CaC1,0.2 g, FesO, 7H, 00.004 gCuSo, 5H,O 0.4 mg, MnSO H,O 0.4 mg, ZnSO.7H,O 0. 4 mgNaMoo2H2O0.24mg; CH COOH6mL.②2固体培养基:含有2%琼脂液体培养基.图实验装置示意图113主要试剂:聚乙烯醇(PVA9950;rg酶、引物合成1恒温水浴:2缓冲液进样口乙醇进样口:4溶氧电极:5溶氧响应仪剂均为国产分析纯I. Thermostat water bath cauldron; 2. Inlet port; 3. Ethanol inlet port: 4Dissolyed o. electrode 5 dissolysensor: 6. Outlet port: 7. Gas vent1.2富集与分离以5%接种量将采集水样接入盛有100mL液体培养基的1.8测量条件的选择600mL盐水瓶中,于120rmin摇床,30℃培养,菌液浑浊后以消耗溶氧为指标,分别测定了温度、pH和NaCl浓度对再次转接进行富集培养富集培养物经固体琼脂培养基平板固定化细胞利用乙醇消耗溶氧的影响划线进行菌株分离19响应时间的测定1.3个体形态与培养物特征的观察菌体染色后在光学显微镜下观察细胞形态在固定琼脂胞,开始测定并记录溶氧变化.开始测定到溶氧下降达到平培养平板上观察菌落特征衡的时间即为乙醇测量的响应时间14碳源利用1.10标准曲线的测定离心收集液体培养的菌体细胞,经无菌水洗涤后,接种配制乙醇浓度分别为0.02%、0.05%、0.2%、0.4%、0于含有20mL液体培养基的130mL盐水瓶中,液体培养基中6%、1%和2%()对标准样品,分别加入测定体系中测定并分别添加不同种类和浓度的碳源,观察细菌生长情况记录相应的溶氧消耗量,绘制标准曲线1.516SDNA序列分析及系统发育分析111千扰物浓度及实际样品的测定提取细菌基因组DNA,以5’- AGTTTGATCCTGGCTCA在0.4%(W)乙醇样品中含有不同浓度的干扰物,分别-3和5’·T^ ACCTTGTTACGA CTTCA3”为引物,进行16 S TDNA测定不同干扰物浓度对乙醇含量测量值的影响,以每种干扰PCR扩增扩增条件为:94℃3min;94℃Imin,60℃45,物浓度对测定值的影响不超过±5%为标准,进行干扰物质及72℃1min,循环30次;72℃10min.PCR扩增产物,经克隆浓度的评价后送上海生工测序.测序序列经 BLAST比对,在 Gen Bank和以95%乙醇(北京化工厂生产)和山西杏花村汾酒集团质EMBL等数据库搜索与该序列相似性较高菌株的序列,进行检处提供的汾酒生产过程中d7和d15固态发酵物的浸提液Clustal x多序列比对,再从MEGA31软件包中选用 Neighbor-为实际样品,分别编号为1、2和3.以本实验方法和气相色谱Joining(NJ)、 Algorithm和 Maximum Parsimony(MP方法构建法分别进行乙醇含量测定,气相色谱仪为GC9800型气相色系统发育树,用 Bootstrap对系统树进行统计检验谱仪(上海科创色谱有限公司),检测器为氢火焰检测器,按16固定化细胞的制备及活化外标法以峰面积计算乙醇含量.后,称菌体湿重称取PVA,加热搅拌溶解,配制0%PA溶2结果与分析液,冷却到35℃左右,加入预温的湿菌体,其中菌体含量为2.1菌株的分离及鉴定3%w/1),混匀,将其滴入pH60饱和硼酸溶液中过夜,蒸馏经两次富集培养和反复平板划线分离获得菌株ME45水洗涤,4℃保存该菌株在不含乙醇的对照培养基及含有乙醇无氧条件中均不活化:每次使用前将适量的固定化细胞放入盛有100生长,而在含乙醇的培养瓶中细菌生长良好表明ME45能利mL液体培养基的600mL盐水瓶中,在转速为120rmin摇床中用乙醇同时消耗氧气,ME45在固体培养基平板上培养4d,见30℃活化1h图2,菌落直径0.6-1.2mm,粉色,圆形,稍隆起,边缘光滑,17测量装置及方法较湿润,不透明.细胞显微观察见图3,细胞短杆状,0.8μmx如图1所示安装测量装置,恒温水浴控制测量体系温10μm,革兰氏阴性,无荚膜和芽孢度,将2mL的测试样品加入18mL的反应体系中,关闭装置的ME4516 S rdNA序列 Genbank登录号为EU567067通气口,待体系溶氧平衡后置入固定化细胞.通过溶氧响应16 SrNA序列系统发育分析见图4,ME45位于 Serine途径期陈亮等:一株乙醇利用菌的分离及其在乙醇含量测定中的应用图2ME45菌落照片Fig. 2 The photo showing of the colony of ME451015202530353ME45显微照片(×1000Fig 3. ME45 in microscope (x1000Methvlobacteriun进化分枝上,与M. luteus 16sDNA序列同源(NaCI)mol L性最高.ME45初步被鉴定为甲基杆菌属( ethvlobacterium)5温度、pH和NaCl浓度对固定化细胞消耗溶氧的影响生理生化测定结果表明,ME45氧化酶和接触酶为阳性;能利 Fig 5 Effects of temperature, pH and NaCl concentration on consumption用葡萄糖、果糖、乙酸钠、乙醇、甲醇、甲烷和甲基胺;不能of dissolved oxygen of immobilized cells刂用癸二酸钠、甜菜碱和酒石酸钾钠.根据形态特征、生理线见图6,加入固定化细菌后,体系溶氧迅速下降,随着乙醇生化特征和16 SrnA序列分析,ME45被鉴定为甲基杆菌属含量的增加,相对溶氧达到平衡的时间有所延长,溶氧消耗的嗜有机甲基杆菌(M. organophilic)12量增大.乙醇含量在0-2%(V)范围内响应过程在25min内Mlethnwoicrobium sp. ATCC 35068(EU144026达到平衡Methnlasarcina lacIs(AYO07296)24乙醇测定的标准曲线Alethnlomonas rubra NCIMB 11913(AF3041乙醇含量与溶氧消耗量的关系曲线见图7.测定体系中乙醇含量增大,细菌对溶氧的消耗量增多,以乙醇含量对相Methylocalchm sp ( DQ496233应的溶氧消耗量作图,经曲线拟合测定体系溶氧的消耗量(y)与乙醇的含量(x)在002%-2%(W)范围内呈函数关系,其拟100[ Strain ME4S (EU567067)合方程为y=14-1.3498,拟合系数(R2)为0.9947,经计算Merhylocela sd/vestris(AJ491847)检出限为1.15×104Aetiyfocapsa acidip/la(J2787262.5干扰物浓度的测定Met/n oocystis sp (AF 150790)在04%乙醇的测量体系中分别含有不同浓度的干扰物Methylasinucs trichasparium(Y18947)质进行测量,干扰物质允许的浓度范围分别以样品中乙醇浓4菌株ME4516 SrNA序列系统发育分析度的倍数表示:甲醇、丙醇、丁醇、甲酸、乙酸、乙酸钠和氨Fig 4 Phylogenetic tree derived from 16S rDNA sequences of strain ME45Numbers at the nodes indicate the bootstrapvalues on neighbor-joining基酸等为5倍,苯酚为0.1倍,葡萄糖、麦芽糖和果糖为7倍anaylsis of 1 000 resampled data sets. Bar 0.022 represents sequence divergence2.6样品含量的测定22测定工作条件的选择进行实际样品的测定以考察系统的准确性和重复性.将由于ME4能够利用乙醇消耗体系溶氧,测试体系的温准曲线的测定范围,并进行多次测定,结果见表1,本实验方度、pH和NaC浓度是影响微生物催化底物反应活性、底物法的测定值与气相色谱的测定值相一致和溶解氧扩散的主要因素.因而在0.05molL磷酸缓冲液中,选用3g固定化细菌,在设计的实验裝置上,对固定化细3讨论胞利用乙醇消耗氧气测定体系的温度、pH和NaC浓度进行目前,普遍认为甲基细菌属的细菌通过RuMP途径进行了优化,如图5所示.因此,选择温度为23℃,含有0.5molL同化作用,属于I型甲烷氧化菌,也有文献报道具有 Serine途NaCl,pH6.8磷酸缓冲体系进行该菌株利用乙醇与消耗溶氧径.l6 S TDNA探针技术已广泛用于细菌的分类鉴定及生态关系的测定学研究,因此我们进行了甲烷氧化菌11个种属及ME45系统发23响应时间的测定育分析,从图4可以看出,11个种属的甲烷氧化菌根据代谢途不同含量乙醇测量体系的相对溶氧()随时间的变化曲径的不同分为两类,菌株ME45及所选 Methvlobacterium菌株562应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Bio15卷系溶氧量增加并波动,对样品检测和系统的温度有重要影响,为简化测量过程,该测定体系在无搅拌的静息条件下进因而响应时间相对较长,实验表明,该法测定乙醇具有操作简便、专一性强、检测范围宽等优点.关于该测量装置微型化及检测方法实现连续化,还需进一步进行研究eferencesFuQJ(傅其军),SuY(苏毅). The seemingly unfaltering growth of thethanol industry. Light Ind(广西轻工业),2005(5):5-92 Tian Ys(田宜水) Zhao LX(赵立欣) Analysis fuel ethanol supply in图6不同含量乙醇测量体系的相对溶氧随时间的变化曲线China Energy china(中国能源),2007,29(12):26-19m22)0建楼Wmu任2mW伟mz傅志时Methods for determination of alcohol. Liquor Making(AR i), 2006, 331.2Wu XJ, Choi MME Spongiform immobilization architecture of ionotropypolymer hydrogel coentrapping alcohol oxidase and horseradishy=14-1.349e(8peroxidase with octadecylsilica for optical biosensing alcoholsolvent. Anal Chem,2004,76(15):4279-4285R2=0.99475 Wen GM, Zhang Y, Shuang SM, Dong C, Choi MMF. Application of abiosensor for monitoring of ethanol. Biosensors bioelectronics, 2007,522.523:121-129/%图7乙醇含量与溶氧耗量的关系曲线6 Zhang hB(张洪波),SuDZ(宿德志),HeYL(何焰蓝). A research onFig. 7 Relationship between dissolved oxygen consumption and differentfourier transform raman spectroscopy of mixed liquor of C, H, OH. Anal& Testing Techno!& Instrum(分析测试技术与仪器),2007,13(3)表1不同样品乙醇含量的测定Table 1 Determination of ethanol in various samples7 Carelli D, Centonze D, Giglio AD, Quinto M, Zambonin PG. Aninterference-free first generation alcohol biosensor based on a gold本实验方法 Our method气相色谱Chromatography RE(o)electrode modified by an overoxidised non-conducting polypyrrole film.N Average(%)RSd(%) N Average(%)Anal Chim Acta. 2006. 565: 27-38 Wang XH(王晓辉),LiX(李新), Sun ys(孙裕生). Sun gh(孙国发)0.8LiXH(李晓红). Study of the ethanol microbial sensor.. Chem sensor(化学传感器),1998,18(3:35-39位于Ⅱ型甲烷利用菌的进化分枝上,说明 Methylobacterium这9Lix(李新), Wang XH(王晓辉). Sun Ys(孙裕生) Study and个属的甲烷氧化菌在进化上同Ⅱ型甲烷利用菌接近,与 Elenapplication on methanol bacterial electrode. Chin j anal chen(分析化等研究报道一致13,1学),199,27(3):281-284本实验室分离到能以乙醇为唯一碳源生长繁殖的菌株10 Zhao GG(赵艮) Zheng J((郑军, Wen GM(温广明, Yang SP(素AE45,并鉴定为嗜有机甲基杆菌(M. organophiliun,据文献萍), Dong c(董川). Isolation and characteristics of a methane-utilizing报道该类细菌具有醇脱氢酶,能够在有氧条件下利用乙 strain and its application for determination of methane gas.Aca醇.因此,利用溶氧测定仪和ME45固定化细胞设计了简单的Microbiol sin(微生物学报),2008,48(3):398-402装置,进行乙醇含量测定的实验.ME45采用乙醇为唯一碳源Wen GM, Zheng J, Zhao CG, Dong C, Choi MMF. A microbialsing system for培养后,对乙醇利用有较强的专一性,以固定化该菌株进行Technol,2008,43:257-26l了乙醇含量测定,测定结果表明该测定体系不受其它醇类物12 Dong XZ(东秀珠, Cai my(蔡妙英) The Common bacteriun质干扰,具有较好的选择性.这也说明该菌株胞内的乙醇脱Systematic Determinative Manual. Beijing, China (t: Science氢酶对乙醇分子的识别和催化有较强的专一性.乙醇含量在Press.2001.145~155002%-2%(W)范围内,溶氧消耗量同乙醇含量呈函数关系,13 Hutchens E, Radajewski S, Dumont MG, McDonald响应时间在25min内;该测定方法在选择性和专一性方面明Analysis of methanotrophic bacteria in Movile Cave by stable isotope显优于密度比重法,与色谱法相比具有成本低、操作简便等probing Environ Microbiol, 2004, 6(2): 111-120优点该生物反应系统的测试范围为002%2%(W),通过4 Liang ZB(梁战备)ShiY(史弈,YueJ(岳进, Advances in the调整实际测试样品的稀释倍数,可以在较大的范围内测定乙research of methanotroph. Chin ecol(生态学杂志),2004,23(5醇含量,其灵敏度、检出限及检测范围均优于已有报道.对95%乙醇和山西杏花村汾酒集团质检处提供的实际样品检15 Hanson RS, Hanson TE Methanotrophic bacteria. Microbio/ Rev, 19960(2):439-47测,测定结果与气相色谱测定值相吻合.由于搅拌使反应体