聚乙二醇修饰对二聚β肽抗肿瘤转移生物活性的影响

肿瘤2000年12月第27卷第12期Tumor Vol.27, No. 12, December ,2007●931●Basic Research.基础研究聚乙二醇修饰对二聚β肽抗肿瘤转移生物活性的影响朱瑞'4, 王松梅”,沈炜明'，刘银坤‘(1.上海交通大学附属胸科医院药剂科,上海200030; 2.复旦大学上海医学院分子生物学实验室,上海200032;3. 上海交通大学附属第六人民医院药剂科,上海200233; 4.复旦大学附属中山医院肝癌研究所,上海200032)[摘要]目的:比较聚乙二醇( plyethylene glycol ,PEG)修饰对二聚β肽(β2)抗肿瘤转移活性的影响。方法:采用纤连蛋白(fronetin, FN)包被细胞培养板作为细胞外基质成分( etracellular matrix, ECM) ,观察β2和PEG修饰物(β 2-PEG)对肝癌细胞株与FN黏附能力的影响;采用Marigel法观察β2肽和β2-PEG对肿瘤细胞侵袭重组基底膜能力的影响。结果:β2和β 2-PEG对SMMC-7721和HCCLM 6细胞与FN黏附均有明显的抑制作用(P<0.05),且呈剂量与时间相关性;PEG修饰物对2种肿瘤细胞的黏附抑制作用均较未修饰的β2肽明显增强(P<0.05)。β2和β2-PEG对HCCLM 6细胞迁移和侵袭均:有明显的抑制作用( P<0.05),迁移抑制率分别为54.6%和56.3% ,侵袭抑制率分别为36.8%和46.6% ,PEG修饰前后差异无统计学意义;β2和β2-PEG对SMC-7721细胞也有显著的抑制作用,迁移抑制率分别为43.6%和45.7% ,侵袭抑制率分别为33.6%和35.9% ,修饰前后差异无统计学意义。结论:β2肽和β2-PEG对肿瘤细胞与FN的黏附具有特异的抑制作用,呈剂量与时间相关性,PEG修饰后抗黏附作用增强。β2肽和β2-PEG对2种肿瘤细胞的迁移和侵袭均有明显的抑制作用,但修饰前后差异无统计学意义。[关键词]癌,肝细胞; 聚乙二醇类;细胞黏附分子;肿瘤侵袭;二聚β肽[中图分类号] R73-362 [ 文献标识码] I[文章编号] 100-7431(2007)12-0931.04The influence of β peptide dimmer modifned by polyethylene glycol on anti-metastasis activityZHU Jun'4, WANG Song-mei2 , SHEN Wei-ming' ，LIU Yin-kun* (1. Department of Pharmacy, Chest Hospital Afiliated toShanghai Jiaotong Universily, Shanghai 200030 , China; 2. Laboratory of Molecular Biology , Shanghai Medical College ,Fudan Uni-versity, Shanghai 200032 ,China; 3. Department of Pharmacy , 6th People 自Hospital ffliated to Shanghai Jaotong University,Shanghai 200233; 4. Liver Cancer Institute , Zhongshan Hospital Afiliated to Fudan University, Shanghai 200032 , China)[ ABSTRACT] Objective:To observe the infuence of β peptide dinmer mdifed by PEG on anti metastasis activity. Methods:Cellculure plates were coated with fibronectin (FN) as extaellular matrix (ECM). The influence of β 2 and β 2-PEC peptides on the ad-hesion of tumor cells to FN were observed. The efects of β 2 and β 2-PEG peptides on migration and invasion ability of tumor cells inreconstituted basement membrane were measured by using Transwell Boyden and Matrigel method. Results:Compared with negative con-trol, β2 and β 2-PEG peptide signifcantly inhibited the adhesion of SMMC-7721 and HCCLM 6 tumor cells to FN in a time- and dose-dependent manner (P <0. 05). The inhibitory ffects of β 2-PEG were stronger than β 2 peptides (P <0.05). The mobility and inva-sion of HCCLM 6 and SMMC-7721 cells were obviously inhibited by β2 peptide and β 2-PEG (P<0.05). For HCCLM 6 cll, β2peptide and β 2-PEG inhibited ell migration were 54. 6% and 56. 3% and suppressed cell invasion 'were 36.8% and 46. 6% , respec-tively. For SMMC-7721 cells, the migration inhibitory rate were 43. 6% and 45. 7% and invasion inhibitory rate was 33. 6% and35.9% by β2 and β 2-PEC peptide, respetively. The dfferenre were not significant before and after PECylation. Conclusions:Theβ2 and β 2-PEC peptides secifically inhibite the adhesion of tumor cells to FN in a time- and dose-dependent manner. The anti-adhe-sion efeetse are enhanced after PEG mdifcation.n The β 2 and β 2-PEG peptides obviously suppress migration and invasion of the twokinds of tumor cells. The diference is not significant before and aftler PEG modification.[KEY WORDS] Careinoma , hepatocellular; Polyethylene glycols; Cell adhesive molecules; Neoplasm invasiveness; Dimmer of βpeptide[Tumor ,2007 ,27(12) :931-934]本课题组根据整合蛋白β亚基的保守序列，自[基金项目] 1. 国家高技术研究发展计划(八六三计划)项目(编行设计了具有抗黏附能力的β肽(DLYYLMDL-号:2001A215411 2004A215201)2.上海市现代生物与新药产业发展基金项目(编号:SYSMK)[0]和二聚β肽(β2),实验证实这2种肽024319212)均能阻断肿瘤细胞与基质之间的黏附性'”。但仍[作者简介]朱明(1964--),女(汉族),博 士,主任医师,硕士生存在中国煤化工相当低，在体内的导师半衰Conespondence to:LIU Yin-kun(刘银坤)MHCN MH G术后的预防用药。Tel:021-64041990-2501根据已有报道策乙一酵( polyetnylene glycol, PEG)E-mail:ykliu@ zshoepital. com修饰多肽能改善其理化性质[8],且采用PEG修饰●932●肿瘤2007年12月,第27卷β 2肽(β 2-PEG)也已获得成功9。因此本实验以的影响在10%FCS-DMEM培养液中培养的肿瘤纤连蛋白( fibronectin, FN)包被细胞培养板作为细细胞铺满培养瓶底后,收集细胞培养.上清液,加入胞外基质成分( extracellular matrix, ECM),观察β 2FN至终质量浓度为5 μg/mL,作为条件培养基。将肽及其PEG修饰物对人肝癌细胞株SMMC-7721及肿瘤 细胞消化后用无血清DMEM稀释成2 x 10°人肝癌高转移细胞株HCCLM6细胞与FN黏附作个/mL细胞悬液,在Transwell上室中加入100 μL用的影响;利用Transwell 细胞培养小室和Matrigel细胞悬液,分别加入用无血清DMEM稀释成200法观察β2肽和β2-PEG对肿瘤细胞侵袭重组基底μmolL的β2肽和β2-PEG以及GRGDS各100膜能力的影响,比较PEG修饰前后β2肽抗肿瘤转μL,对照组加入无血清DMEM 100 μL。下室加入移活性的变化。600 μL条件培养基,置于体积分数5%的CO2培养箱中培养16h。从双室培养板中取出Transwell小1材料与方法室,吸弃液体,用棉签擦净未穿透聚碳酸酯微孔滤膜1.1 材料β2肽β 2(DLYYLMDLSYSMKGGD-的细胞,PBS漂洗后10%甲醛固定,Giemsa染色30LYYLMDLSYSMK)由复旦大学附属中山医院肝癌研min,ddH2O冲洗。取下微孔滤膜,在200倍显微镜究所自行设计,上海生工生物工程公司合成;GRGDS下计数上下左右中5个不同视野的迁移细胞数,取(甘-精-甘-天冬-丝)、无关肽( MKGGDLYYLMDLS)由平均值,计算迁移抑制率。迁移抑制率=[1-(处上海生工生物工程公司合成;β 2-PEG由本实验室理组迁移细胞数对照组迁移细胞数)] x 100%。自行制备。1.2.4 β2 肽和β 2-PEC对肝癌细胞株侵袭能力1.2方法的影响Matrigel 用无血清DMEM稀释10倍,以每1.2.1 β2 肽和β2-PEG对肝癌细胞株与FN黏附孔75 μL包被Transwell上室,37C放置2 h使其成能力影响的剂量关系将1 x10'个/mL以10%胶。细胞和药物的加入方式同1.2.3节,体积分数为BCS-RPMI1640培养的SMMC-7721细胞悬液或5%的CO2培养箱中培养48 h。取出Transwell小室,10% FCS-DMEM培养的HCCLM 6细胞悬液加入FN吸弃液体,用棉签擦净基底膜胶, PBS漂洗后10%甲包被的96孔板中,每孔100μL。以GRGDS作为阳醛固定,Giemsa染色30 min , ddH20冲洗,200倍显微性对照,无关肽作为阴性对照,β2肽和β 2-PEG为镜下计数上下左右中5个不同视野的侵袭细胞数,取实验组,将4种肽稀释成20、40.100和200μumol/L,平均值,计算侵袭抑制率。侵袭抑制率=[1-(处理每孔加人100 μ,终浓度为10 、20、50和100 μmo/L，组侵袭细胞数/ 对照组侵袭细胞数)] x 100%。同时设空白组(200 μL细胞培养液)及对照组(加入1.2.5统计分析 不同多 肽浓度或作用时间对细100 μuL 细胞及100 μL培养液) ,每组设5个复孔。胞黏附的抑制,采用线性相关( linear correlation)分37C、体积分数为5%的CO2共培养3 h后洗去未黏析,并计算相关系数r,显著性水平为0.05。迁移和附细胞,噻唑蓝( thiazolyl blue , MTT)法检测96孔板侵袭实验结果采用t检验,以P <0.05认为有迁移上细胞浓度,观察剂量关系,同时比较PEG修饰的抑制作用或侵袭抑制作用。统计软件为SAS 8.2影响。细胞黏附抑制率= (对照组平均D值-处理(SAS Institute Inc.，Cary, NC, USA)。组平均D值)/(对照组平均D值一空白组平均D2结果值)x100%.1.2. 2 β2肽和β 2-PEG对肝癌细胞株与FN黏2.1β2肽和β2-PEG对肿瘤细胞与FN黏附的抑.附能力影响的时间关系将β 2、β 2-PEG、GRGDS制作用不同浓度的β2肽和β2-PEG对HCCLM6和无关肽分别稀释成200μmol/L,以每孔100μL加和SMMC-7721细胞与FN黏附的抑制率见表1;β 2人到FN包被的96孔板中,加入100μL细胞(1x肽和β 2-PEG作用不同时间对HCCLM 6和SMMC-10'/mL),同时设空白组及对照组,每组设5个复7721细胞与FN黏附的抑制作用见表2。与无关肽孔。379C、体积分数为5%的CO2分别培养0.5.1、组相比较,β 2肽、β 2-PEG以及GRGDS对1.5、2.3 h,洗去未黏附细胞,MTT法检测96孔板上HCC中国煤化工泡与FN的黏附均细胞D值,观察时间关系，同时比较PEG修饰的影有显fYHCN M H逋着多肽依度的升响。细胞黏附抑制率计算同1.2.1节。高,黏刚抑利华也增向,全现刑重相关关系,差异有1.2.3 β2肽和β 2-PEG对肝癌细胞株迁移能力统计学意义。与细胞共培养不同时间,β2肽、β 2-第12期.朱珺,等 聚乙二醇修饰对二聚β肽抗肿瘤转移生物话性的影响●933●PEG和GRCDS对HCCLM 6细胞及SMMC-7721细现时间相关关系,差异有统计学意义。而无关肽无胞与FN的黏附都表现出显著的抑制作用,且随着此现象,且β 2-PEG对2种肿瘤细胞与FN黏附的作用时间的延长,对细胞黏附的抑制作用越明显,呈抑制作用均强于β2。表1不同浓度的多肽对肿瘤细胞的抑制率Table 1 The effect of different concentrations of peptides on tumor cell adhesion to FN(%,n=5)Inhibitory rate of adhension ep/( pumol. L-I)Cell linePeptide1205(00HCCLM 6β211. 8021.7028.5048. 700.97<0.05β2-PEC13.60 .24.9039.8060.90<0. 05GRCDS11. 1018.2023.3049.200.98Irrelevant0.21.110.180.31SMC-7721β8.50 .16.2020. 7028. 700.92β 2-PEG10.2019.5025.9035.900.93CRCDS6.80.11. 4025. 6033.' 700.960.120. 160.210.170.69表2多肽作用不同时间对肿瘤细胞与FN黏附的抑制率Table 2 The effect of peptides on tumor cell adhesion to FN at different times(% ,n=5)Inhibitory rate of adhension /h1.523.610.216.829.50.9949.814.118.422.733.70.99711.410.919.327.548.60. 9675.43.80.40.358SMMC-77214.97.89.112.60.9426.810.413.224. 134.20.984GRGDS7.111.723.424.80.913Irelevant2.50.11.70.32.2 β2 肽和β 2-PEG对肿瘤细胞迁移能力的影比,细胞数明显减少(P<0.05),抑制率分别为响HCCLM 6细胞加入100 umol/L的β2或β2- 33. 6%和35.9% ,但PEG修饰前后差异无统计学意PEG后,细胞的迁移均受到抑制，与对照组相比,细义,表明PEG修饰后不影响β2肽抑制细胞侵袭的胞数明显减少(P <0.05) ;抑制率分别为54.6%和功能,见表4。56.3%,但PEG修饰前后差异无统计学意义。表3 β2 肽和β2-PEG对肿瘤细胞迁移SMMC-7721细胞加人100μmoVL的β2或β2-能力的影响PEG后,细胞的迁移均受到了抑制,与对照组相比,Table 3 The efets of β2 and β 2-PEG peptides细胞数明显减少(P <0. 05) ;抑制率分别为43. 6%on migration of tumor cells(n=5)和45.7% ,但PEC修饰前后差异无统计学意义。结果表明PEG修饰后不影响β 2肽抑制细胞迁移的GroupNumber of migrated Inhibitorycells(示士s)rate/%功能，见表3。16. 90 +S. 624.62.3 β2肽和β 2-PEG对肿瘤细胞侵袭能力的影β 2-PEC16.27 46.346.3响HCCLM6细胞在加入100pumoVL的β2或CRGDS15. 38 t5.3658.7β2-PEG后,细胞侵袭均受到了抑制,与对照组相37.24 +8. 59比，,细胞数明显减少(P<0.05),抑制率分别为SMMC中国煤化工13.636.8%和46.6%,但PEG修饰前后差异无统计学意YBCNMHG45.7义。SMMC-7721细胞在加入100 μmol/L的β2或Control64.23 t9.50●934●肿瘤2007年12月,第27卷表4 β2和β 2-PEG修饰物对肿瘤细胞饰物对肿瘤细胞迁移和侵袭能力的影响与未修饰多侵袭能力的影响肽基本相似,说明β2肽经PEG修饰后主要影响了Table 4 The effects of β2 and β 2-PEG peptides on肿瘤细胞与FN的黏附。invasion of tumor cells(n=5)生物学研究结果证实,β2肽经PEG修饰后,仍Cell lineCroupNumber of invasion Inhibitory1具有明显的抗黏附和抗迁移、侵袭能力,与未修饰多ells(i+s) rale/%'肽相比,作用增强或基本相似，说明PEG修饰β 2HCCLM 612. 20 +6.236.8<0.05肽可能为肿瘤转移的预防性治疗提供新的手段。β 2-PEG10.30+5.446.6GRCDS9.54 44.350.6PEG修饰的最大优点是能使多肽体内的半衰期延SMMC-7721Control19. 30+9.3长,因此对于其整体实验和药代动力学参数,有待进.β217.01 +7.533.616.44 +6.435.9-一步深人研究。15.67 +5.838.9<0. 0525.64 +6.3[参考文献][1] LIU YK, YANF, UEMURA T. The binding ability to matrix pro-teins and the inhibitory eets on cell adhesion of eynthetic pep-3.讨论tides derived from a conserved sequence of integins[J]. J Biochem, 1997 ,121(5) :67-74.FN是细胞外基质中的细胞黏附分子,在肿瘤的2] 孙婧骤，周信达，贺建宇,等β肽对棵鼠人肝癌切除术后转移侵袭转移过程中起着重要作用10-14]。肿瘤细胞与复发的阻断作用[J].中华实验外科杂志，200,17(5):418-FN黏附的测定已成为人们研究肿瘤细胞转移常用420.方法之一。本实验以FN包被细胞培养板模拟[3] UEMURA T, NEMOTO A, LIU Y K. Synhetic peptide derivedfrom a conseved sequence of integrin β subunit[J]. Res Adu Bio-ECM,以GRGDS作为阳性对照,同时用无关肽作为sei Bioeng, 2000 ,20(1): 65-83.阴性对照,研究了β2肽和β2-PEG对肝癌细胞与[4]孙婧珊,周信达 ,刘银坤,等抗黏附药物对裸鼠人肝癌转移复FN黏附抑制作用的影响。结果表明其抗黏附作用发防治的实验研究[J].中华消化杂志, 2000 ,20(1) :53-54.特异,且呈现剂量效应和时间效应相关关系,同时发[5]孙婧珊,周信达,刘银坤,等. β肽防治肝癌转移复发的研究[J].中华普通外科杂志，2000,15(1):27-31.现PEG修饰后抗黏附作用明显增强。6] SUN JI, ZHOU XD, uU YK, et al. Inhibitory efets of synthetice肿瘤细胞的迁移能力和侵袭能力在转移中也起β peptide on invasion and metatasis of liver caner[J]. CancerRes Clin 0ncol, 2000 ,126(2) :595-600.重要作用。采用Transwell培养小室来研究肿瘤细[7] 王松梅,朱玛,李岩,等β肽及其多聚物对人肝癌细胞胞的迁移能力是较常用的方法。通过观察穿越滤膜株与基质黏附的抑制作用[J].实用肿瘤杂志, 2006 ,21(3):细胞数量的变化可了解肿瘤细胞迁移的能力。在278-281. .Transwell培养小室微孔滤膜上铺就人工基底膜胶,[8] VERONESE FM,SACC A B,SERQI M, et al. New PECs for peptide and proein modifcation,sutable for inifcatioin of PECyla-模拟了肿瘤细胞在机体内侵袭基底膜的过程。结果tion site[J]. Bioconjug Chem ,2001 ,12(1) :62-70.表明,β2肽和β 2-PEG对两种细胞迁移和侵袭均[9] 朱珊，王松梅，沈炜明,等.抗肿瘤转移多聚β肽聚乙二醇有明显的抑制作用，而且PEG修饰并不影响β2肽化的研究[J].中国新药与临床杂志,2005 ,24(9) :723-726.[10] OKEGAWA r, uU YK, PONG R, et al, Cell adhesion proteins的抗迁移和侵袭能力。as tumor sppesors[J]. Inuest Urol, 2002 ,167(4) :1836-1843.在黏附实验中,β2肽和β 2-PEG可能通过以.[11] GIANCOTTI F G. Integin signaling[J]. Science, 1999, 285下两种途径抑制肿瘤细胞与FN的黏附:(1)β2肽(5430) :1028-1032.和β 2-PEG与含有RGD序列的所有基质蛋白结合，[12] AZNAVOORIAN s, STETIER-STEVENSON W, LIOTT L A.Molecular aspects of tumor cell invasion and metastais[J]. Canc竞争性地结合了整合蛋白的结合位点;(2)由于β2er,1993, 71(2):1368-1383.肽和β 2-PEG来源于整合蛋白的保守序列，所以也[13]刘银坤,吴伟忠,吴欣,等 肝癌转移与信号传导[M]/汤钊能和整合蛋白结合,从而抑制整合蛋白的黏附活性。猷.肝癌转移复发的基础与临床.上海:上海科技救育出版社，体外试验结果显示,修饰物的抑制作用明显高于未2003 :93-104.修饰物。可能原因是:修饰物的水溶性明显增加,使[14]周信达,刘银坤.原发性肝癌复发转移防治的临床与基础研究其更容易与含有RGD序列的基质蛋白结合,也更容[收稿中国煤化工修回日期] 200704-19易与整合蛋白结合。在迁移和侵袭试验中, PEG修[本文HCNMHG