海杞片的提取工艺研究

2014年3月中成药第36卷第3期Chinese traditional Patent MedicineVol. 36 No. 3[7]潘金火,何满堂,罗兰.垂盆草药材质量控制方法研究9]高爱国,浅谈片剂制粒工艺控制[.齐鲁药事,200[J].成都中医药大学学报.2002,25(1):44558]潘金火,潘萍.垂盆草总黄酮中8种单体成分对肝细胞[10]刘利清,胡佳文.复方丹参片薄膜包衣工艺研究[J].中的保护作用[J].中国医院药学杂志,2010,30(19)国药业,2010,19(5):37海杞片的提取工艺研究李振华,蔡字,蔡天革2(1.暨南大学药学院,广东广州510632;2.辽宁大学生命科学院,辽宁沈阳110036)摘要:目的优选菊花中绿原酸及海杞片中多糖的提取工艺。方法采用单因素试验结合正交试验的方法优选最佳提取工艺条件。结果菊花中绿原酸的最佳提取工艺为溶剂用量20倍,乙醇体积分数75%,超声提取1次,提取时间20min;多糖最佳提取工艺为15倍药材量的水,浸提温度90℃,浸提时间1.5h,提取2次。结论菊花中绿原酸及处方中多糖的最佳提取工艺稳定可行,为样品进一步研究奠定了基础。关键词:绿原酸;多糖;提取工艺;正交试验中图分类号:R284.2文献标志码:B文章编号:1001-1528(2014)03-064904oi:10.3969/jisn.1001528.2014.03.049海杞片由海金沙、桑椹、枸杞、菊花四味中药材组成,为色谱纯,其他有机溶剂均为分析纯,水为纯净水。具有增强免疫力,清热解毒之功效,其主要有效成分是绿2实验方法与结果原酸与多糖。绿原酸( chlorogenic acid)属酚类化合物,是2.1优选绿原酸最佳提取工艺方法与结果植物细胞在有氧呼吸过程中经磷酸戊糖途径(HMS)的中2.1.1绿原酸的测定间产物合成的苯丙素类物质原酸具有抗病毒、抗2.1.1.1色谱条件流动相为乙腈.4%磷酸水溶液菌、免疫调节、清除氧自由基2、增强白血球、保肝利(13:87),体积流量L.0mL/min,检测波长327mn,R&C胆、抗肿瘤、降血压、抗氧化及兴奋中枢神经系统等多种(研创)C1色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)。药理作用。多糖是一类天然大分子化合物,具有排2.1.1.2对照品溶液的制备取绿原酸对照品适量,精密铅6、降血脂、调节免疫等多种作用8,受到国内外众称定,用甲醇定容得50μg/m的绿原酸对照品溶液多学者的关注。为深入研究海杞片,本实验以绿原酸和多2.1.1.3供试品溶液的制备取菊花药材4g,加入75%糖为评价指标,采用单因素考察和正交试验的方法首次对乙醇80mL,浸泡0.5h,超声提取20min,过滤,滤液蒸海杞片的提取工艺进行了系统研究。干,所得绿原酸甲醇溶解并转移置10mL量瓶中,定容1仪器与试验材料取该样品溶液0.5mL于10mL量瓶中定容,即得供试品LC-10AT型液相色谱仪、SPD-10A型紫外检测器(日溶液。本岛津公司);R&C(研创)C色谱柱(5μm,4.6mm×2.1.1.4标准曲线的绘制取配置好的绿原酸对照品(52250mm); Hanbon液相微量进样器,100μL;TU1810s紫g/mL),2、4、8、12、16、20μL,注入液相色谱仪,测外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);定峰面积。以峰面积对进样量(ug)作标准曲线。其回归EYELA型旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司);HHS型方程为Y=1.0×10°X+685.3,r=0.9995,结果表明绿原电热恒温水浴锅;GzX9140MBE型电热恒温鼓风干燥箱酸在0.11~0.66#g范围内线性关系良好(上海博讯实业有限公司);KQ-250E超声波清洗器(昆山2.L.1.5精密度试验取同一绿原酸对照品溶液连续进样市超声仪器有限公司);绿原酸对照品(广州市药品检验6次。结果RSD为1.29%,说明本方法精密度良好所,批号:110753-200413);菊花、海金沙、枸杞、桑椹2.1.1.6稳定性试验精密吸取供试品溶液20μL,室温等药材购自广州二天堂药店,经鉴定为正品;甲醇、乙腈下每隔2h进样一次,测定绿原酸峰面积。结果RSD为收稿日期:201347-13基金项目:辽宁省科学技术计划项日(2010225013)中国煤化工作者简介:李振华(1987—),女,硕士生,从事中药药剂专业。Emul:365022370@qCNMHG*通信作者:蔡天革,教授,研究方向:中药提取与制剂。Te:(024)82086731,Em2014年3月中成药March 2014第36卷第3期Chinese traditional patent medicineVol. 36 No. 31.4%,说明供试品在12h内稳定性良好结果的影响不显著,各因素的主次顺序为B>C>A>D,2.L.1.7重复性试验称取菊花4g共6份,按供试品溶综合极差结果及简便性因素,最佳提取工艺确定为溶剂用液项下的方法制备成供试品溶液,按测定条件测定并计算量20倍,乙醇体积分数为75%,提取时间为20min,提取绿原酸的量,结果RSD为1.42%,说明本实验重复性1次,即:A1B2C1D1。良好2.1.4绿原酸的最佳提取工艺验证试验按最佳提取工艺21.1.8加样回收率试验取已知含有量的4g菊花药材条件,重复3次验证试验。结果绿原酸的量分别为2388平行6份精密称定。分别加入一定量绿原酸对照品,按供24.78、24.36μg/mL,平均值为24.34ug/mL,RSD为试品溶液制备项制成加样供试品溶液。同法注入高效液相1.85%,说明所筛选的最佳提取工艺条件稳定,方法可行。色谱仪,测定绿原酸峰面积,计算回收率。菊花提取液中2.2优选多糖最佳提取工艺方法与结果绿原酸平均回收率为99.3%,表明本方法的回收率良好。2.2.1多糖的测定2.1.2绿原酸的单因素试验2.2.1.Ⅰ标准溶液的制备精密称取已干燥至恒重的葡萄2.1.2.1提取方法对绿原酸的影响取4g菊花药材2份,糖50mg,置于50mL量瓶中,加水溶解,定容。精密吸取分别加入0.1L50%乙醇,一份超声提取2次,每次3050mL,置于50mL量瓶中,加水定容,即得0.1mg/mmin,一份加热回流提取2次,每次2h,合并滤液,依法的葡萄糖标准溶液。测定。结果绿原酸质量分数分别为940.1、504.2g/g,表2.21.2供试品溶液的制备分别称海金沙、枸杞、桑明超声方法明显优于回流方法。椹,菊花四味药材。将菊花用乙醇(75%)提取绿原酸后2.1.2.2溶剂对绿原酸的影响分别称取4g菊花药材5与其他3种药材一起加水提取,合并提取液,纱布过滤份,分别用0.1L水、乙醇、50%乙醉超声提取2次,每离心,上清液浓缩,醇沉2次,冰箱静置过夜,过滤,得次30min。合并滤液,依法测定。结果绿原酸质量分数分沉淀,沉淀用无水乙醇及丙酮交替洗涤2-3次,干燥即得别为:762、1186、1635μ/g,表明50%乙醇提取效果最粗多糖。精密称取干燥粗多糖5mg于50mL量瓶中,加水好,乙醇、水次之。溶解并定容,即得供试品溶液。2.1.3绿原酸的正交试验根据单因素试验结果及绿原酸2.2.1.35%苯酚溶液的制备称取苯酚5g,置于100mL性质。选取溶剂用量、乙醇体积分数、提取时间及提取次棕色量瓶中,加水充分溶解,定容,即得。数为考察因素。正交试验设计及结果见表12.2.1.4标准曲线的绘制分别精密吸取葡萄糖标准溶液表1正交试验设计及结果0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL于10mL量瓶中,加水至2.0mL,再加入5%苯酚溶液1.0mL,浓硫酸5.0A(溶剂B(乙醇体积C(提取D(提取绿原酸用量倍)分数%)时间m)次数)(:m2m,摇匀放置5m,80℃水浴加热15m,取出,冷却20(1)1(1)16.15220(1)75(2)30(2)2(2)18.01曲线,其回归方程为Y=0.049X-0.003,r=0.999,说明320(1)100(3)40(3)3(3)10.40多糖在1335~8.01Hg/mL范围内线性关系良好。30(2)3(3)11.962.2.1.5样品中多糖的测定精密吸取供试品溶液0.830(2)75(2)40(3)1(1)18.37mL于10mL量瓶中,加水至2mL,按标准曲线的绘制项630(2)100(3)20(1)2(2)15.80740(3)50(140(3)2(2)下操作,将所测吸光度值代入线性方程,求质量浓度C,840(3按以下公式计算多糖的量。940(3)100(3)30(2)1(1)7.66多糖(mg/g)C×D×干膏质量x1000kI14.85312.13718.92314.060测定多糖所称取的样品质量×药材质量k215.37720.40012.54314.037其中,D为稀释倍数。k313.59311.28712.35715.722.2.2多糖的单因素试验R1.7836.5672.2.2.1料液比对多糖的影响固定提取温度80℃,提表2方差分析取时间2h,1次,浓缩时的药液比1:1,醇沉2次。考察方差离差自由不同的料液比(1:6、1:9、1:12、1:15、1:18)对多均方来源平方和度糖的影响。结果多糖质量分数分别为7.9、9.5、13.55.04210.5、10.7mg/g。表明多糖量随加水量的增加先增加后下B152.058<0.05降,当加水量为1:12时,多糖量最高。C83.860241.93016.632>0.055.6342.8171.1172.2.2.2提取时间对多糖的影响固定料液比1:12,提>0.05取温度80℃,提取次数1次,浓缩时的药液比1:1,醇沉注:Fa06(2,2)=19.02次。考察中国煤化工5、2、2.5h)对结果分析:因素B(乙醇体积分数)对试验结果影响多糖的影响CNMHG1、1.0、12.5显著,因素C(溶剂用量)和因素D(提取时间)对试验1.5、11.8mg/g表明多糖量随提取时间的延长先增加后2014年3月中成药March 2014第36卷第3期Chinese traditional Patent MedicineVol. 36 No. 3下降,提取时间在1h时,多糖量达到最高。说明所筛选的最佳工艺条件较稳定,方法可行。2.2.2.3提取温度对多糖的影响固定料液比1:12,提3讨论取时间2h,1次,浓缩时的药液比1:1,醇沉2次。考察海杞片由海金沙、桑椹、枸杞、菊花四味中药材组成,不同温度(60、70、80、90、100℃)对多糖提取效果的其中构杞为君药,菊花为臣药,其他两味中药为辅药”。影响。结果多糖质量分数分别是18.7、24.2、28.2、17.8、海杞片是以绿原酸及多糖为有效成分的复方制剂,本研究18.1mg/g。表明多糖量随提取温度的升高先增加后减少。首先采用超声提取方法提取菊花中绿原酸成分,菊花残渣当提取温度为80℃时,多糖量最高再与海金沙、桑棋、枸杞合并后以水为溶剂提取活性成分222.4浓缩药液比对多糖的影响固定料液比1:12,多糖,从而保证了两种功效成分的有效提出。绿原酸是由提取温度80℃,提取时间2h,I次,醇沉2次。考察不同咖啡酸与奎尼酸形成的酯,其分子结构中有酷键、不饱和的药液比(1:0.75、1:1、1:1.25、1:1.5、1:1.75、双键及多元酚三个不稳定部分),提取时不能高温、强光1:2)对多糖提取效果的影响。结果多糖质量分数分别为及长时间加热,故本研究优选了以75%6乙醇为溶剂的超声9.7、12.4、1l7、13.2、14.2、119mg/g,表明多糖量随提取工艺。实验结果表明超声提取技术可作为绿原酸提取着药液比增加变化不规律,总体是先增加后下降,当药液的有效方法的有效方法之一,具有提取效率高,提取时间短,节省溶比为1:1.75时,多糖量最高。剂,操作简单等特点,但其用于大生产的提取条件还有待22.3多糖的正交试验固定浓缩时的药液比(1:15),于进一步研究"。以多糖量为考察指标,选取料液比(加水量)、提取温度、根据单因素试验结果及绿原酸性质,选取溶剂用量提取时间、提取次数为考察因素,按L(32)正交表进行乙醇体积分数、提取时间及提取次数为考察因素进行正交试验,正交试验设计及结果见表3、表4。实验,结果表明乙醇体积分数对试验结果影响显著。综合表3正交试验设计及结果极差结果及简便性因素,确定最佳提取工艺为溶剂用量20D多糖倍,乙醇体积分数为75%,提取时间为20min,提取1次。序号(加水量)(温度/℃)(时间/h)(次数)(mg·g-)多糖正交试验以多糖含量为考察指标,选取加水量、提取9(1)70(1)0.5(1)1(1)2.67温度、提取时间、提取次数为考察因素,结果表明提取温9(1)80(2)1.0(2)2(2)10.33度具有显著性差异,结合极差结果及简便、经济等因素确(1)90(3)1.5(3)3(3)14.92定最佳提取工艺加水量为15倍,温度90℃,提取1.5h12(2)70(1)1.0(2)3(3)7.4412(2)80(2)5(3)1(1)提取2次。绿原酸和多糖最佳提取工艺经过3批试验验证,612(2)90(3)0.5(1)2(2)12.1l上述工艺均稳定可行,为处方进一步研究奠定了基础715(3)70(1)1.5(3)2(2)9.22本研究确定了海杞片有效成分绿原酸和多糖的提取工815(3)80(2)0.5(1)3(3)13.43艺,为有效控制海杞片的有效成分及制剂研究提供了依据915(3)90(3)1.0(2)1(1)9.25同时也为海杞片的研发奠定了基础。9.68011.0839.00710.553参考文献10.63312.09311.21011.9305.6504.793[1]周荣汉,中药资源学[M].北京:中国医药科技出版社表4方差分析[2]陈娟娟,方建国,万进,等,绿原酸体外抗人巨细胞病毒方差离差自由的实验研究[J].医药导报,2009,28(9):1138141均方FP来源平方和度[3 Boon A M, Vos A P, Graus Y M F, et al. In vitro effect of2.2081.404bioactive compounds on influenza virus specific B-and T-cell re-54.47227.236sponses[J]. Scand J Immuno, 2002, 55(1): 24-324.1382.95[4 Wu Hezhen, Luo Jing, Yin Yanxia, et al. Effects of chlorogen18.27213.01ic acid an active compound activating calcineurin purified from注:Fa0(2,2)=19.0Flos Lonicerae on macrophage[ J]. Acta pharmaco! Sin, 2004结果分析:影响因素大小顺序为B>D>C>A,由方5(12):1685-1689差分析可知,因素B(即提取温度)具有显著性差异,结[5]刘军海,裘爱泳.绿原酸及其提取纯化和应用前景[J].粮合极差结果及简便、经济等因素来确定最佳提取工艺为食与油脂,2003(9):446[6]宁红梅,葛亚明,雒海潮,等.枸杞多糖促排铅功效初步研A3B3C3D2,即加水量为15倍,温度90℃,提取1.5h,提究[冂].郑州轻工业学院学报,2011,26(2):11取2次。7]杨小红,周远明,张瑜.白首乌多糖降血脂作用研究4多糖的最佳提取工艺验证试验按最佳提取工艺条J].时珍中国煤化工2件平行提取处方量药材3份,结果多糖含有量分别为15.0、[8]董宏坡,江CNMHG的免疫调节15.5、15.2mg/g,平均值为15.23mg/g,RSD为1.6%作用[J].中成约,2010,32(3):491496512014年3月中成药March 2014第36卷第3期Chinese Traditional Patent MedicineVol. 36 No. 3「9]邓中甲,李冀.方剂学[M].北京:中国中医药出版社,实验研究[J].中成药,2011,33(6):1078-108012]勾建刚,刘春红,白茅根多糖超声提取的优化[J].时珍国[I0]陈绍华,王亚琴,罗立新.天然产物绿原酸的研究进展医国药,2007,18(11):27492750J].食品科技,2008,33(2):195198[13]蔡宇,超声法提取枸杞多糖工艺条件优选[J.中成药[1黄永光,钟红茂,李康,等.超声辅助提取螺旋藻多糖的2010,32(10):1820-1822高效液相色谱法测定六味地黄丸的溶出度吕兴萍2,胡容峰,叶蕾',丁领振(1.安徽中医学院,安徽合肥230038;2.江苏农林职业技术学院,江苏镇江212400)摘要:目的建立以丹皮酚、马钱苷为指标成分,测定六味地黄丸溶出度的方法。方法照《中国药典》2010年版二部溶岀度测定法中的小杯法,以200mL脱气人工胃液(无酶)为溶出介质,转速100m/min,温度(37.0±0.5)℃。采用高效液相色谱法外标法定量, Hypersil C色谱柱(250mmx4.6mm,5μm);流动相A为0.05%磷酸溶液,B为乙腈梯度洗脱;体积流量1.0mL/min;检测波长为234m(马钱苷)、274mm(丹皮酚)。结果丹皮酚、马钱苷分别在4.03~36.27μg/mL(r=0.994)、3.02-27.18wg/mL(r=0.995)范围内呈良好线性关系,平均回收率分别为99.60%、98.47%,RSD分别为1.51%、1.82%。结论本方法简便可靠,精密度高,重复性好,可用于六味地黄丸溶出度的测定。关键词:六味地黄浓缩丸;高效液相色谱;溶出度中图分类号:R927文献标志码:B文章编号:1001-1528(2014)034065203doi:10.3969/j.isn.1001-1528.2014.03.050六味地黄丸是被誉为“补阴方药之祖”六味地黄方的其工作站,浙江智达N00作站; Hypersil C(5μm,一种制剂,由熟地黄、山药、山茱萸、牡丹皮、泽泻、茯250mmx4.6mm)色谱柱,ZRS8G智能溶出试验仪(天苓六味中药组成,千百年来受到广大医家和患者的推津大学无线电厂);十万分之一电子天平(德国 Sartorius公崇。溶出度是模拟口服固体制剂在胃肠道崩解和溶出的司);TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通过体外试验方法,不仅能反应丸剂的质量情况还能反应体内仪器有限公司)。的吸收和药效情况,因此建立溶出度的测定方法具有一定2方法与结果意义。现行版药典中尚未收载对六味地黄丸的溶出考2.1色语条件流动相A为0.05%磷酸溶液,B为乙腈察2),另外到目前为止只有极少数关于六味地黄丸溶出度梯度洗脱0-15min,86%A;15-40min,50%A。柱温研究的报道,且都是针对单一成分的考察。本实验是在25℃,体积流量1.0ml/min,DAD检测器,马钱苷检测参考文献[7-11]基础上采用高效液相色谱法以代表性水溶波长为234m,丹皮酚为274mm。在上述色谱条件下,取性成分马钱苷和代表性难溶性成分丹皮酚s3为指标对照品和样品溶出液进样,结果表明两个成分能与其他成测定了六味地黄丸的体外溶出度,为评价和控制六味地黄分达到较好的分离,且理论塔板数均大于3000,结果见图丸的质量提供了依据。1仪器与试药2.2溶液的制备六味地黄丸(1071071,北京同仁堂),丹皮酚对照品2.2.1对照品溶液精密称取丹皮酚对照品4mg、马钱苷( paeonol,中国药品生物制品检定所提供,批号为110708对照品3mg,分别置于100mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释200506);马钱苷对照品( loganin,中国药品生物制品检定至刻度,摇匀即得对照品贮备液。所提供,批号11140201005);乙腈为色谱纯;岛津LC-2.2.2供试品溶液参照《中国药典》2010年版二部溶10ATvp高效液相色谱仪, Agilent10O高效液相色谱仪及出度测定法(附录XC第三法),以200mL0.1mol/LHCl收稿日期:2013-02-12基金项目:国家自然科学基金资助项目(81173556)作者简介:吕兴萍(1981—),女,讲师,硕士生,研究方向:中药新剂型。Tel:(*通信作者:胡容峰,女,教授,硕士生导师,研究方向:中药新剂型与新制剂TH中国煤化工-B702007@sohu.comCNMHGongfeng(@ 163652