乙醇对土壤转化酶活性的影响

第34卷第9期西北农林科技大学学报(自然科学版)2006年9月 Vol. 34 No. 9 Jour. of Northwest Sci-Tech Univ. of Agri. and For. (Nat. Sci. Ed.)Sep.2006乙醇对土壤转化酶活性的影响王聪颖,和文祥,何敏超(西北农林科技大学资源环境学院,陕西杨凌712100[摘要]研究了不同浓度乙醇对土壤转化酶活性的影响以及不同底物(蔗糖)浓度对乙醇与转化酶活性关系的影响。结果表明,乙醇可明显抑制土壤转化酶活性,其浓度与土壤转化酶活性呈显著或极显著相关,其作用方式为直接抑制乙醇轻度污染时的生态剂量ED1值为29.47%~35.27%,表明乙醇是一种毒性不强的有机污染物;底物浓度可放大乙醇与土壤转化酶活性之间的关系;乙醇加导致土壤转化酶的Km和vm值小,揭示其作用机理为完全抑制作用,包括竞争性和非竞争性抑制作用。[关键词]乙醇;转化酶活性;动力学;作用机理[中图分类号]S154.2[文献标识码]A[文章编号]1671-93872006)09-0125-05乙醇作为一种有机污染物,其来源非常广泛,可染的程度;甲苯进入土壤后会显著提高土壤脲酶的大量存在于一些生活和工业废水中在土壤有机物活性,甲醇可增加大多数土壤脲酶的活性等但至今质(秸秆、有机肥料等)的转化过程中也会形成乙醇。有关乙醇对土壤酶活性的影响鲜见报道为此本试此外,某些农药原药在使用时也需要加人乙醇。这些验研究了乙醇对土壤转化酶活性的影响,以期为环乙醇最终都会进入土壤生态系统,对土壤性质包括境保护提供重要依据。其中生长的微生物等产生影响因此,乙醇生态毒理效应的研究在理论和实践上具有十分重要的意义。1材料与方法土壤酶是土壤的重要组成部分,在物质转1.1供试土样化能量代谢和污染物降解等方面发挥着重要作用。土样于2002-03采自西北农林科技大学从近年来,国内外许多学者3研究了外源污染物(主1979年开始的土壤长期肥料定位试验地(培肥方案要包括重金属、农药及其他有机物质)对土壤酶活性见表1)。采样时先去除0~5cm的表土,再取5~20的影响,并且取得了较大的进展,如发现采用多个土cm土层的土样,混匀风干后,过1mm筛备用。壤酶构建的酶系统可较为敏感地表征土壤重金属污表1供试土壤的培肥方案 Table, 1 Design of long-term fertilizer experiment kg/hm2'土样编号 Soil samples处理尿素过磷酸钙秸秆 Treatment Urea Ca(H2PO)2肥 Straw Manure无肥o- o-fertilizer0000化肥 Chemical fertilizer52500高 High straw4505375000450525375001.2乙醇对土壤转化酶活性的影响基水杨酸比色法0测定土壤转化酶活性。土壤转化取5.00g土样,向其中加入5滴甲苯后,再加1酶活性单位定义为每小时在1g土样中由蔗糖转mL不同体积分数(0%,5%,10%,25%,50%,化成葡萄糖的毫克数。每处理重复3次,并设无底物100%)的乙醇溶液混匀后静置30min,最后加15和无土壤处理为对照。mL浓度为80g/L的蔗糖溶液和5mL磷酸缓冲液1.3底物浓度对乙醇与土壤转化酶活性关系的影响(pH5.5),摇匀,37C培养5h后取样。用3,5-二硝以1号土样为例,实验方法同1.2.1,底物蔗糖[收稿日期]2005-10-08[基金项目国家自然科学基金项目(4030102)国家973重点基础研究发展计划子项目(2004CB418506)[作者简介]王聪颖(1981),女[通讯】王聪(1=:,西长人,在读硬士,主要从事土壤生物化学和生态毒理研究e-malwxh968163.co要从事土壤生态毒理研究者]和文(19男陕西黄龙126西北农林科技大学学报(自然科学版)第34卷的浓度分别为:0.010,0.025,0.050和0.100应初始和t时间时的底物浓度。mol/L,取样时间为3hS1.4乙醇作用时间对土壤转化酶活性的影响将不同时间的n和(S-[S])值进实验方法同1.2.1,乙醇浓度为体积分数50%,行线性拟合,即可求得Km和Vm值静置时间分别为:0,15,30,60,120和240min。1.5.2对土壤转化酶促反应速度常数k的影响1.5乙醇对土壤转化酶动力学特征的影响以1号土样为例来研究乙醇对土壤转化酶动力k=nvv,式中,V和V分别为酶促反应产学特征的影响。生的最大葡萄糖量和t时间产生的葡萄糖量。1.5.1对土壤转酶动力学参数Km和的影2结果与分析响经典米氏方程: V.= X [S]2.1乙醇对土壤转化酶活性的影响 Km+[]结果显示,(1)土壤转化酶活性大小次序为:1经数学变换为:号土样<2号土样<3号土样<4号土样,其中1和 In S-Kx ([S.]-[S])+4号土样的土壤转化酶活性分别为0.77和1.08mg/(g·h),二者相差40.26%(表2)。这表明土壤式中,t为酶促反应时间;[S]和[S]分别为酶促反转化酶活性与土壤肥力水平密切相关。表2不同浓度乙醇对土壤转化酶活性的影响 Table 2 Invertase activity in soils tested under different concentrations of ethanol mg/)土样编号乙醇体积分数/% Concentration of ethanol Soil sample051025501000.770.760.70.670.610.5720.920.810.790.800.740.6631.071.130.950.850.740.821.081.110.980.9440.880.83注:100%的乙醇指的是分析纯级乙醇 Note: 100% means that ethanol is analytical grade.(2)与对照相比,除3号和4号土样中加入5%结果类似。的乙醇使土壤转化酶活性升高外,其余浓度乙醇的(3)当乙醇浓度为5%~100%时,随乙醇浓度加入均导致土壤转化酶活性降低,当乙醇浓度达到增加,土壤转化酶活性总体上持续减小(表2)为此100%时,1,2,3,4号土样的土壤酶活性与各自的乙采用 Speir等[12提出的U=A/(1+B×C)模型,对醇体积分数为0时的酶活性相比,降幅分别为本研究中的乙醇浓度(C)与转化酶活性(U)的关系25.97%,28.26%,23.36%和23.15%(表2)这与进行拟合,结果见表3。 Sannino等研究发现的甲醇对土壤转化酶的影响表3土壤转化酶活性与乙醇浓度关系的拟合结果 Table Regression equation between soil invertase activity and ethanol concentration土样编号参数 Parameters Soil sampleAB ED10/%0.7520.3770.95629.470.8570.3150.90235.271.04510.4710.7781.0630.3400.90936.28注:自由度n-2=4.0=0.81,ra.01=0.917;表示显著相关;表示极显著相关表5同 Note: Freedom n-2= 4,. =0. 811,. 0. 917. remarkable correlation, :significant remarkable correlation. Table 5 is the由表3可知,除3号土样外,其余土样的U与C用的机理为完全抑制作用包括竞争性的和非竞争 to this table.均呈显著或极显著负相关表明土壤转化酶活性受性的抑制作用。乙醇浓度影响显著,乙醇对土壤转化酶活性抑制作(4)土壤酶生态剂量(Ecological dose)中的第9期王聪颖等:乙醇对土壤转化酶活性的影响127ED113表示土壤酶活性抑制幅度达10%时所需要加到100%时,土壤转化酶的最大表观活性急剧降的外界污染物的浓度或剂量,通常也作为土壤受到低,与对照相比,降低了0.105mg/(g·h)。由以上轻度污染时外源污染物的临界浓度由表3可见,不数据可知,不同体积分数的乙醇对土壤转化酶活性同土样间土壤转化酶的ED1值为29.47%~的抑制作用相差9.55倍,表明在不同底物浓度下,35.27%,最大相差仅为6.81%,表明乙醇对土壤转乙醇对土壤转化酶具有明显的抑制作用。化酶的作用受土壤肥力的影响较小。此外,要达到轻(3)采用一元一次线性方程对酶活性(U)与乙微污染的程度,5g土样中要含有1mL体积分数为醇浓度(C)间关系进行了拟合,结果见表5。由表530%~35%的乙醇溶液,这从客观上讲是不可能的可以看出,乙醇对土壤转化酶活性具有明显的抑制这一结果表明乙醇对土壤转化酶的毒性不强,即乙作用,与前面的规律是一致的,底物浓度的大小并不醇是一种污染效果不严重的外源污染物。影响乙醇与土壤转化酶活性之间的关系,但其可放2.2底物浓度对乙醇与土壤转化酶活性关系的影响大土壤转化酶受影响的程度。由图1可知,(1)随蔗糖浓度增大,土壤转化酶0.7活性持续增加。当蔗糖浓度从0.010mol/L升高到0.100mol/L时,乙醇浓度为0的土样中土壤转化0.6酶活性从0.280mg/(g·h)增大到0.6060.5mg/(g·h),增幅达到53.80%。0.40%;(2)在乙醇浓度相同时,随底物浓度的增加,土0.3.5%壤转化酶活性的增加幅度减小采用模型U=A10%;0.225%BC/(1+BC)拟合底物浓度(C)与土壤酶活性0.150%(U)的关系14,结果见表4,拟合方程得到的A值就0100%是土壤酶的最大表观酶活性。由表4可知,不同浓度00.010.0250.050.1乙醇的U和C均达到极显著相关,表明所拟合的方底物浓度(moll Substrate concentration程可较好地揭示二者之间的关系。最大表观酶活性随乙醇浓度增加呈先增加后降低的变化趋势,其中图1底物浓度对乙醇与土壤转化酶活性关系的影响乙醇体积分数小于50%的土壤转化酶最大表观活 Fig. Soil invertase activity affected by different concentrations of ethanol and substrate性变幅最高为0.011mg/(gh),而当乙醇浓度增表4土壤转化酶活性与底物浓度关系的拟合结果 Table 4 Regression equations between soil invertase and substrate concentration乙醇体积分数/%参数 Parameter Cthanol concentrationAB00.69262.5460.99850.68862.610.998100.64868.67156.1050.998250.701.995500.70340.1130.991001.000注:自由度n-2=4=0.50.990表示显著相关;*,表示极显著相 Note:Freedom n-2=4, ra os =0. 950,. =0. 990: remarkable correlation: .significant remarkable correlation.表5不同底物浓度下土壤转化酶活性与乙醇浓度的拟合方程 Table 5 Regression equations between ethanol concentration and invertase activities by different substrate concentrations参数底物浓度/(mol/l) Substrate concentration Parameter0.0100.0250.0500.100A0.28030.40660.51380.6052B(10-2)0.0848460.08040.09470.10280.9350.9500.9280.900128西北农林科技大学学报(自然科学版)第34卷2.3乙醇作用时间对土壤转化酶活性的影响示15。反应速度常数k反映反应在本质上是“快”还由图2可知,供试土样转化酶活性在乙醇作用是“慢”,其值与底物浓度无关。时间为0min时最大,此后随着作用时间的延长略由表6可知,(1)与对照(乙醇体积分数为0)相有降低其中1号和2号土样转化酶活性的最大降比,随乙醇浓度的增加,除体积分数5%乙醇处理的幅分别为16.41%和16.0%;3、4号土样在作用时间土样Km略有升高外,其余处理的Km值均有不同为30min时的酶活性最低,与0min相比,降幅分程度的降低,最大相差达到40%,表明乙醇的加入别为21.56%和0.92%,此后酶活性又有所增加。相导致土壤转化酶与底物(蔗糖)的亲合力增加,酶促关性分析结果显示1号土样转化酶活性与作用时反应更易进行。但乙醇浓度从10%到100%时,土壤间呈显著负相关(r=-0.853,n-2=4)表明作用转化酶酶促反应的Km变化较小,说明乙醇浓度的时间对乙醇与土壤转化酶活性的影响较小且变化增加对酶与底物的亲合力影响较小。规律不强。(2)除体积分数5%乙醇处理的土样外,其余处理土壤转化酶酶促反应的Vm均小于对照。由此可no.1 -.NO.2:2.0n.3 *-NO.4知,当乙醇体积分数由10%增加至100%时,土壤转1.5化酶一底物复合体的解离速度逐渐降低,即乙醇对土壤转化酶具有非竞争性抑制作用161.0(3)土壤转化酶酶促反应的反应速度常数k随0.5乙醇浓度变化而变化的规律性不强。与对照相比,除0乙醇体积分数为5%和100%处理的土壤转化酶的k值等于或小于对照外,其余处理的k值均大于对100200300时间/min照,但增幅较小,最大增幅为6.77%表明在本试验 Time的条件下,乙醇对土壤酶促反应速度影响较小。图2体积分数50%乙醇作用时间对土壤(4)不同乙醇体积分数下,土壤转化酶的Km转化酶活性的影响与V值呈现极显著的正相关(r=0.959,n-2= Fig. Soil invertase activity affected by4),表明乙醇减弱了酶促反应中底物与酶的亲合力, 50% ethanol at different time增大了酶一底物复合物解离的速度。2.4乙醇对土壤转化酶动力学特征的影响(5)当乙醇体积分数为5%时,土壤转化酶的在米氏方程中,米氏常数Km表征酶与底物结Km和值均比对照及其余处理增大但其酶活合的牢固程度,当Km值小时,酶与底物结合牢固,性与对照相比却减小,说明体积分数5%的乙醇增亲合力大;最大反应速度Vmx是总酶量的量度,可表大了酶一底物复合物解离的速度,最终导致土壤转征酶底物复合物分解为酶和产物的速率,对土壤来化酶活性降低。可见酶动力学参数从多方面揭示了讲其是土壤实现某种酶过程的潜在能力的容量指土壤酶促反应机理等方面的差别。表61号土样转化酶酶促反应的动力学参数 Table 6 Kinetic parameters of invertase of No. I soil tested Ethanol concentration (umol-L-.g-.h)Km/(mmol·l-1k/(10-5)0.46619.731.1370.608500.49222.161.1370.5670.39711.851.2140.837250.40413.251.1840.769500.43414.161.1969741000.39914.151.1000.90.986注:自由度为n-2=14,r.=0.497r0.01=0.623,示显著相关表示极显著相关 Note Freedom n-2=14. 0. 497, a. # 0. 623; remarkable correlation; . significant remarkable.3结论活性,乙醇浓度与土壤转化酶活性呈显著或极显著相关,底物浓度可放大这种抑制作用;乙醇对土壤转本试验结果表明,乙醇可明显抑制土壤转化酶化酶活性的抑制作用为完全抑制作用,包括竞争性第9期王聪颖等乙醇对土壤转化酶活性的影响129和非竞争性抑制;乙醇的作用时间对土壤转化酶活来看,乙醇是土壤中的一种轻度污染物。性有影响,但规律性不强所以从土壤生态毒理角度参考文献] [1] Burns R G. 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The ecological dose values (ED were calculated, ranging from 29. 47% to 35.27%, it shows that ethanol is a lightly toxic pollutant The substrate concentration can enlarge the influencing extent. With ethanol input, soil invertase kinetic parameters Km and values decreased, so the reaction mechanism is a kind of total inhibition between ethanol and invertase, including no-competitive and competitive. Key words: ethanol soil invertase activity kinetic characteristic; reaction mechanism