合成气和培养基组分对C.autoethanogenum发酵产乙醇的影响研究

第32卷第9期太阳能学报Vol 32. No 92011年9月ACTA ENERGIAE SOLARIS SINICASep.,2011文章编号:025440%6(2011)09-1370405合成气和培养基组分对C. autoethanogenum发酵产乙醇的影响研究郭颖12,许敬亮!,徐惠娟',袁振宏,梁翠谊(1.中国科学院广州能源研究所,中国科学院可再生能源与天然气水合物承点实验室,广州510640;国科学院研究生院,北京100049)摘要:以合成气发酵菌株 Clostridium autoethanogenum DSMI0061为研究对象研究改良DSM培养基640,添加玉米浆焦油含量和产物浓度对合成气发酵的影响。结果表明:玉米浆浓度为0.175gL时利于合成气乙醇发酵。适量的焦油有利于乙醇的生成抑制乙酸的产生。低浓度的乙醇和乙酸能促进对应产物乙酸和乙醇的生成,但随着浓度的升高,乙醇和乙酸均会严重抑制产物的生成。关键词:合成气发酵; Clostridium autoethanogenwm;乙醇中图分类号:TK5114文献标识码:A0引言1材料和方法合成气乙醇发酵即将木质纤维素原料全组分1.1菌株(包括纤维素、半纤维素和木质素)全部气化,转化发酵菌株C. autoethanogenum DSM10061购于为以H2、CO和CO2为主要组分的合成气,然后再德国菌种保藏中心 Deutsche Sammlung von Mikroor利用特殊的微生物将合成气发酵为乙醇。该工艺可 ganismen und Zellkulturen gmbH(DSMZ, Braun-有效避开木质纤维素酸、酶水解的技术障碍,实现木 schweig, Germany)。质纤维素类生物质组分的全利用,此外,气化过程产1.2培养基及配置方法生的热还可用来供暖,做到生物质资源的高效利用。DSM640培养基(/L):氯化镁0.40g,氯化铵目前,在合成气制备方面,国内外的研究均已较0.90g氯化钠0.90g,氯化铁2.5mg,磷酸二氢钾为成熟,通常可通过控制热解工艺条件或气化方式1.50g,磷酸氢二钾0.75g,酵母膏1.00g,木糖5.00g,制备出高质量的合成气。目前,国外合成气发酵研纤维二糖1.0g,半胱氨酸0.75g,刃天青0.50mg究主要集中在发现较早的 Clostridium jundah和10mL微量元素溶液,pH=6.0。Clostridium carboxidivorans两株专利菌上214),而针改良培养基(/L):硫酸镁0.20g,氯化铵1.00g,对非专利菌 Clostridium autoethanogenum的研究则较氯化钠0.80g氯化钙0.02g磷酸二氢钾0.1g,氯化少131。本研究拟通过改良发酵培养基的配方,考钾0.1g,酵母膏1.00g,木糖5.00g,半胱氨酸C. autoethanogenum发酵的影响试图开发出合成气维生素贮液,pH=6.0(7'l0mL微量元素溶液10mL察不同玉米浆浓度、焦油组分和产物浓度对0.75g,刃天青0.50mg发酵的高效转化工艺技术,为加快这一工艺的实用发酵培养基(凵):硫酸镁0.20g,氯化铵1.00化进程做有益探索。氯化钠0.80g,氯化钙0.02g,磷酸二氢钾0.10g,氯中国煤化工收稿日期:20090927基金项目:中国科学院知识创新工程重要方向项目(KGCX2YW335;KSCX2dHCNMHG发展(863)计划(2007AAO57406)通讯作者:许敬亮(1977-),男,副研究员,主要从事生物质能源的开发。习@ms,ge,wc,cn9期郭颖等:合成气和培养基组分对C. autoethanogenum发酵产乙醇的影响研究1371化钾0.1g,酵母膏0.15g,半胱氨酸0.75g,刃天青后,再以40℃/min升至250℃。0.50mg,10mL微量元素溶液,10mL维生素贮液,pH=4.5,CO/CO2(95/5)(21。2结果与讨论维生素贮液(L):吡哆醇0.010g,维生素B10005g,核黄素0.0058,泛酸钙0.008g,硫辛酸2.1培养基改良0005g,对氨基苯甲酸0.005g,烟酸0.005g,维生素按5%的接种量,将发酵菌株分别接入培养基B20.005g,生物素0.002g,叶酸0.002g,2-巯基乙烷DSM640和含5g/L木糖的改良培养基中,37℃,培养磺酸钠( MESNA)0.010g。104h,测其OD值,结果如图1。微量元素贮液(/L):氨三乙酸2.00g,硫酸锰00g,硫酸亚铁铵0.80g,氯化钴0.20g,硫酸锌0.20g,氯化铜0.02g,氯化镍0.02g,钼酸钠0.02g硒酸钠0.02g,钨酸钠0.02g。所有培养基在灭菌前先放入厌氧箱(N285%,H210%,CO25%)中24~36h,缓慢除去其中的溶解氧,并加入0.5mg/L的刃天青做为指示剂,然后100120121℃高压蒸汽灭菌20min。维生素溶液和还原性剂时间h半胱氨酸采用0.45μm的滤膜过滤除菌。图1菌株C. autoethanogenum在培养基DSM640上的13合成气组分的影响生长曲线接种发酵菌株到只含气态碳源CO或CO2的发Fig. 1 Growth curve of C. autoethanogenum cultured with酵培养基中,37℃,培养72h后离心取发酵液上清,edium DSM640分析产物组成。前期研究发现,细胞干重和OD值的对应关系14玉米浆浓度的影响为每ODa值对应C. autoethanogenum的细胞干重为剔除发酵培养基中的酵母膏和维生素,在以CO304mg/L。由图1可知,菌株C. autoethanogenum在为气态碳源的发酵培养基中添加不同浓度的玉米改良培养基的生长曲线近似与其在培养基DSM40浆(00.0750.150、0.2810.375g/L),37℃,分别培的生长曲线,可见C. autoethanogenum菌株也能在养72h,发酵液离心取上清分析产物组成。改良培养基中生长良好(见图2)1.5焦油及其主要组分的影响参考合成气中焦油的实际组成和含量,添加不同浓度的焦油组分,研究它们对C. autoethanogenum发酵产物组成的影响。16产物浓度的影响将不同浓度的乙醇、乙酸分别加人到合成气发酵培养基,以研究产物浓度对C. autoethanogenum发酵产物组成的影响。时间/h17产物分析将发酵液于-4℃,14000min离心10min,取图2菌株 C autoethanogenum在改良培养基上的生长曲线上清分析。乙醇和乙酸浓度含量测定采用 AgilentFig 2 Growth curve of C. autoethanogenumcultured with the developed medium6820气相色谱,检测器采用FID,柱子为30mx0.25mm×0.25μ m DB-FFAP载气为氮气,载气流率2合成气组分的影响将C.中国煤化工30mL/min,分流比1:50。色谱进样口和检测器的温接入以CO或度分别为250℃和30℃。色谱柱温初始温度为CO2为气态以…人CNMH,培养72h。取发40℃,维持5min,然后以20℃/min速度升至140℃酵液离心取上清分析产物组成,结果如图3和图4。1372太阳能学报32卷由表1知,当玉米浆浓度为0075g/L时乙醇产O2乙酸2乙醇量高于含酵母膏的培养基中的乙醇产量,显著高于T含酵母膏的乙酸产量。此后,随着玉米浆浓度的升高乙醇产量逐步降低,而乙酸产量在0.281g/L后又礼1略有升高。浓度为0.075g/L的玉米浆最适合乙醇的生成。因此,该浓度的玉米浆可用于替代传统培养基中的维生素和酵母膏。2.4焦油主要成分的影响时间/h生物质气化后会含有焦油等杂质。焦油成分复图3C. autoethanogenun菌株利用CO2发酵产杂,不同气化条件下焦油成分差异很大,但均含有一乙醇和乙酸定量的甲苯和苯酚,因此将焦油(模拟实际焦油中的Fig 3 Production of ethanol and acetic acid by含量)加入培养基,37℃,培养72h。提取发酵液,研C. autoethanogenum with CO, as carbon source究其对发酵产物组成的影响,结果如表2表2C. autoethanogenum菌株对焦油主要成分的耐受性Table 2 tolof C. autoetteCo乙醇main components of tarsCO乙酸添加物含量/mg·L1乙醇/mg·L乙酸甲苯0.886216苯酚焦油时间/hCK图4C. autoethanogenum菌株利用CO发酵产乙醇乙酸由表2可知,甲苯能使乙醇的产量略微升高,但ig. 4 Production of ethanol and acetic acid by乙酸产量却有一定程度的下降。苯酚能使乙醇的产cO as carbon source量显著升高,乙酸产量有一定程度的下降。添加焦由图3和图4知,发酵菌株利用CO产乙醇和乙油也能使乙醇的产量升高,但乙酸的产量也有一定酸的产量均高于利用CO2发酵的产量。合成气组分程度的下降。由此可知,焦油的主要成分能促进乙中CO是能被C. autoethanogenum菌株较好利用的气醇的生成并有抑制乙酸产生的作用。态碳源。故选择CO作为进一步研究的气态碳源。Ahmed A等研究发现合成气中微量的焦油能2.3玉米浆浓度的影响促进C. carboxidivorans发酵产物中乙醇生成并抑制乙酵母膏和维生素是合成气发酵培养基的主要组酸产生。由表2知焦油对株 C. autoethanogenum的分,使用成本相对较高。本实验试图用相对廉价的影响类似于焦油对 C. carboxidivorans菌株的影响但玉米浆替代发酵培养基中的酵母膏和维生素,以降这规律(即焦油抑制乙酸产生促进乙醇产生的机低培养基的成本,结果如表1理)是否普遍适于合成气发酵菌株还有待进一步研表1玉米浆浓度对 c autoethanogenum发酵产物组成影响究。Table 1 Effects of com steep liquor concentration on the2.5产物浓度对合成气发酵的影响production of C. autoethanogenum为了验证发酵菌株是否存在产物反馈抑制现玉米浆/g·L酵母膏/g·L乙醇/m·L乙酸/mg,L象将发酵菌株C. autoethanogenum的发酵产物乙0.15475酸(同时也是焦油的主要成分)和乙醇分别添加到不同浓度的乙0.0750000061772h,提取发酵中国煤化工,37℃,培养情况,结果如0.281表3。由表3司A是限及以好把业著促进乙酸0.375的生成但高浓度的乙醇反而抑制乙酸的产生。同9期郭颖等:合成气和培养基组分对C. autoethanogenun发酵产乙醇的影响研究1373样,一定浓度的乙酸能促进乙醇的生成,但随着乙酸obic ethanol and acetate producing microorganism[P]浓度的上升,也能抑制乙醇的产生。因此在连续培U.S.:5173429,1992养C. autoethanogenum时,乙醇和乙酸积累到一定[3] Tanner R S,MrLM, Yang D. Clostridium yjungdal程度时,应尽快移除,以减弱高浓度产物对菌株发酵sp-nov, an acetogenic species in clostridial ribosomal-rma的影响。homology group-I[J]. International Joumal of SystematicBacteriology,1993,43(2):232-236.表3C. autoethanogenum菌株对其产物的耐受性[4 Najafpour G, Younesi H. Ethanol and acetate synthesisTable 3 Tolerance of C. autoethanogenum to the productsh culture of Clostridium添加物含量/g·L1乙醇/m·L-1乙酸/ng·Ldahli[ J]. Enzyme and Microbial Technology, 2006, 38乙醇50.0(1-2):223-228乙醇5.03816[5] Younesi H, Najafpour G, Mohamed A R. Ethanol and ac-乙醇0.54515乙酸50.0processes using anaerobic bacterium, Clostridium ljung-乙酸5.062dahlin[ J]. Biochemical Engineering Journal, 2005, 27乙酸0.5(2):110-119475[6] Ahmed A, Lewis R S, Fermentation of biomass-generated需要指出的是,C. auloethanogenum菌株用以合synthesis gas: Effects of nitric oxide[ J]. Biotechnology成气发酵,最终的乙醇产量很低(最高仅89mg/L)。and Bioengineering, 2007, 97(5): 1080--1086虽然这一结果略高于文献[13]用培养基DSM640在[7] Rajagopalan S, Datar R P, Lewis R s. Formation of etha-连续供气的反应器中获得的60mg/L乙醇浓度,但nol from carbon monoxide via a new microbial catalyst该产量比通过其他方法得到的乙醇产量低很多。因J]. Biomass& Bioenergy, 2002, 23(6): 487-493此需要进一步提高合成气发酵产乙醇的能力。一方8] Datar R P, Shenkman R M, CateniB G,etl. Fermenta-面可以通过反应器的设计增加气液传质的速率,使tion of biomass-generated producer gas to ethanol[ J]. Bi菌株能更好地利用合成气,从而提高乙醇的产otechnology and Bioengineering, 2004, 86(5): 587-量1)。另一方面也可以通过发酵培养基和发[9] Lewis R S, Randy S H, Raymond,el. Biomass to酵工艺优化,来提高乙醇的产量H。ethanol: A holistic approach using gasification-fermenta3结论tion[J]. Abstracts of Papers American Chemical So2004,227(1):2961)C. autoethanogenum菌株能在成分相对简单[10] Lewis R s, Tanner R s, Huhnke R L. New biologically的改良培养基中生长良好。可以用0.075g/L的玉pure culture of Clostridium carboxidivorans, useful for in米浆替代发酵培养基中的酵母膏和维生素;direct and direct fermentation of biomass to fuel alcohol2)合成气组分中的CO较CO2更适合充当[P].U.S.:2007275447-A1,2008C. autoethanogenum E株发酵的气态碳源。焦油的[11] Lewis R S, Frankman R S, Allyson T, et al. Ethanol via主要成分能促进乙醇的生成抑制乙酸的产生;biomass-generated syngas[J]. Intemational Sugar Jourl,2008,l10(1311):1503)低浓度的乙醇和乙酸能促进对应产物乙酸和乙醇的生成但随着浓度的升高,乙醇和乙酸均会严[12] Ahmed A, Catena B G, Hunker l,etal. Effects of bieneratedr gas constituents on cell growth重抑制产物的生成。product distribution and hydrogenase activity of Clostridia[参考文献]um carboxidiDorans P 7[J].Biomass2006,30(7):665-672[1] Huber G W, Iborra S, Corma A. Synthesis of transporta- [13]Cotter J L, Chinn M S, Grunden A M. Influence oftion fuels from biomass: Chemistry, catalysts, and engi-中国煤化工 ridium如 indahneering[J]. Chemical Reviews, 2006, 106(9):4044and closCNMH ENthesis gas[J]Enzyme andrechnology,2009,44(5):2812 Gaddy J L, Clausen E C. Clostridium ljungdahlii, an aer-1374太阳能学报32卷[14] Cotter J L, Chinn M S, Grunden A M. Ethanol and ace-autoethanogenum using resting cells[J]. Bioprocess andtate production by Clostridium yiungdahlii and ClostridiumBiosystems Engineering, 2009, 32(3): 369-380STUDY ON COMPOSITION EFFECTS OF SYNGAS AND MEDIUMON ETHANOL PRODUCTION WITH Clostridium autoethanogenumGuo Ying, Xu Jingliang, Xu Huijuan, Yuan Zhenhong, Liang Cuiyi'(1. Key Laboratory of Renewable Energy and Gas Hydrate, Guangzhou Institute of Energy Conversion, Chinese Academy of SciencesGuangzhou 510640, China: 2. Graduate Universiy of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049,ChinaAbstract The medium DSM640 was further developed for the syngas fermentation of acetogen Clostridium autoeth-anogenu. The effects of different concentrations of com steep liquor, main components of tars and composition ofproducts on the ethanol production of C. autoethanogenum were studied. The results showed that 0. 175g/L of cornsteep liquor is suitable for syngas fermentation and appropriate contents of tars contributed to the production of ethanol and hampered the production of acetate. Lower concentration of ethanol and acetate are good for the productionof ethanol and acetate, and the production ethanol and acetate would be seriously inhibited conversely with the in-creasing of the product concentrationKeywords: syngas fermentation; Clostridium autoethanogenum; ethanol中国煤化工CNMHG