多肽和蛋白质的聚乙二醇化修饰方法

2003 年第23卷有机化学Vol. 23. 2003第11期，1320- 1323Chinese Jounal of Organice ChernisiryNo. 11. 1320- 13.学术动态.多肽和蛋白质的聚乙二醇化修饰方法王良友” 刘克良(军事医学科学院毒物药物研究所北京100850)摘要聚乙二醇是一类具有独特理化性 质的大分子聚合物多肽和蛋白质类药物经聚乙二醇共价修饰后能明显改善其药代学和药效学性质，,如降低免疫原性、增加对蛋白水解酶的稳定性.增加水溶性及延长体内的半衰期等.蛋白质的聚乙二醇化修饰研究已取得较好的效果.多肽的聚乙二醇化修饰研究起步较晚.对近年来多肽和蛋白质的聚乙二醇化修饰方法进行了综述.主要介绍了对多肽和蛋白质的N端.C端及某些氨基酸侧链进行选择性聚乙二醇化修饰的方法.关键词聚乙二醇, 聚乙二醇化修饰,多肽,蛋白质Methods of Peptide and Protein PegylationWANG, Liang You"LIU, Ke-Liang( lstiute of Phamacologo and Toriology, Academy of Miliany Melical Scienes ，Beying 100850)Abstract With typical molecular weights of 500 ~ 20000, polyethylene glycol (PEC) is nontoxic, nonimmunogenicand soluble in aqueous solutions as well as in most organic solvents. The covalent atchment of PEC ( pegylation) topeptides and proteins can significantly improve their pharmacological and biological properties, such as shieldingimmunogenic epitopes, preventing degradation by proteolytic enzymes, increasing solubilty, reducing renal fltrationand altering biodistribution. Some methods in this field especially on site-directed pegylation for amino, carboxyl andthiol groups of peptides and proteins are reviewed.Keywords polyethylene glycol, pegylation, peptide, protein聚乙二醇(palyethylene glycol, PEG)是一类具有独特理化步的研究表明.蛋白质经聚乙二醇化修饰后还可以改善许多性质的大分子聚合物.它具有良好的水溶性,也能溶于二氯其它方面的性质,如增加蛋白质对酶的稳定性、延长蛋白质甲烷、N":N"-二甲基甲酰胺、苯、乙腈和乙醇等有机溶剂.聚乙在血浆中的半衰期、增加在水中的溶解度等|1-~3l.-.些蛋白二醇由环氧乙烷聚合而成,通过控制反应条件可得到平均分质的聚乙二醇化修饰物在作为药物的应用中取得了较好的子量由几百到几万的聚合物.普通的聚乙二醇分子两端各有效果.1991年,第一种经聚乙二醇化修饰的蛋白质类药物一个羟基,若一端以甲基封闭则得到单甲氧基聚乙二醇PEG腺苷脱氨酶被FDA批准.上市'4 ,用于治疗- .种严重的(mononethoyolyethylene eyco, mPEG). 在多肽和蛋白质的儿童免疫缺陷症. 2001年,用聚乙二醇修饰的干扰素(PEC-聚乙二醇化修饰(eglain)研究中应用最多的是mPEG的INTRON)经FDA批准上市15.),用于治疗慢性丙型肝炎.多衍生物.肽与蛋白质在理化性质上具有许多相似之处.肽类化合物的聚乙二醇化修饰研究晚于蛋白质的相关研究,近年来关于肽PEG: HO -(CH2CH20)n- -CH2CH2-0H类化合物的聚乙二醇化修饰研究也取得了一些进展.尤其是mPEG: CH2O -(CH2CH20)。- - CH2CH2- -OH肽类化合物在聚乙二醇化定点修饰方面较蛋白类物质更易于实现，因此开展肽类化合物的聚乙二醇化修饰研究也具有蛋白质的聚乙二醇化修饰研究始于二十世纪七十年代，较重要的意义.最初的目的主要是为了降低蛋白质类药物的免疫原性.进-一在多肽的聚乙二醇化修饰研究中应用最普遍的是中国煤化工E-mail: liangwang@ 163. net; Te!: 01066932302; Fax: 010-68211656.Received Febnuary 26. 2003; resed June 1l, 200; acopted August 7, 200.MHCNMHGNo.11王良友等:多肽和蛋白质的聚乙二醇化修饰方法1321mPEC,先在mPEG的末端引人羧基、氨基或其它活性基团，或者制备经mPEC修饰的氨基酸衍生物，再利用固相或液NK相法将其偶联到肽序列中去.实现对多肽的N端,C端及某些氨基酸侧链的聚乙二醇化修饰.下面主要介绍近年来文献mPEG-0H + Ts-ClEgN. mPEG-OTs .报道关于多肽和蛋白质的聚乙二醇化定点修饰的- -些方法.1多肽和蛋 白质中氨基的聚乙二醇化修饰方法H2N-NH:H2OmPEG- -NmPEG-NH2在多肽和蛋白质的聚乙二醇化修饰方法中，主要是对NmPEG-NHCOCH2CH2COOH末端或赖氨酸侧链氨基进行酰化修饰因为蛋白结构中通常存在多个氨基,所以控制和确定修饰位点及修饰程度-直是Scheme 1蛋白质的聚乙二醇化修饰中的一个难点.肽类化台物的合成中可以通过采用适当的保护策略来实现对氨基的定点修饰.Lee等[9]以平均分子量为5000 的单甲氧基聚乙二醇甲1.1 N端氨基的酰化修饰酰琥珀酰亚胺(SC-mPEG)在弱碱性水溶液中(pH= 8)修饰鲑为了实现对肽链中氨基的聚乙二醇化酰化修饰,需要在降钙素(sCT),经RP-HPLC分离得到N端1y"和Iys"侧链聚乙二醇上首先引入羧基或活化的羰基.1993年,Lu等[1]首氨基分别被聚乙二醇酰化修饰的三种产物,产物结构经酶解先报道了在固相多肽合成中应用单甲氧基聚乙二醇的羧基和质谱分析得到确证,它们在大鼠肾脏匀浆中的半衰期分别術生物对肽链的N端氨基进行酰化修饰的方法:以mPEG作为125.5, 157.3和281.s min,比sCT在大鼠肾脏匀浆中的半原料,先合成mPEG- -OCH2CO0H 和mPEC-0CH2CO- -Nle-衰期(4.8 min)显著增加.用相同的方法,Lee等[10以平均分OH,在mPEG中引入一个正亮氨酸(Nle)作为标记是为了便子量为3400的SC-mPEC对表皮生长因子(EGF)进行修饰，于确定每一-个多肽分子上偶联了几个mPEC分子.应用Fmoc经RP-HPLC分离到N端、Ly38和Lys8S侧链氨基分别被聚乙固相多肽合成法,先在树脂上合成全保护肽链，当游离出N二醇酰化修饰的三种产物.生物活性测定表明,N端修饰产末端氨基后,以BOP作缩合剂,将mPEG--0CH.CO- -Nle-物活性高于Ly?"和Lys侧链修饰产物.OH作为一个单体偶联到肽链上,然后经三氟乙酸裂解和反SC-mnPEG及其类似物在蛋白质的聚乙二醇化修饰中应相高效液相色谱(RP.HPLC)纯化得到了平均分子量分别为用较多,反应条件容易实现,一般在弱碱性的水溶液中进行.2000和5000的mPEG修饰N.端的4肽.8肽和12肽,mPEG控制蛋白质和SC-mPEG的比例可以得到单聚乙二醇化修饰修饰产物在RP-HPLC分析图谱上呈单一峰,结构经MALDT-的产物产物的纯化方法也比较简便,可用透析电泳及凝胶TOF-MS分析得到确证研究还表明，聚乙二醇对三氟乙酸处色谱等常用方法实现.由于SC-mPEC对游离氨基没有选择理稳定,但氟化氢处理时会有部分断裂,故此法不适用于性,当有多个氨基时,往往难以实现定点的聚乙二醇化修饰，Boc固相多肽合成法(Eq.1).分析和确定产物中聚乙二醇的修饰位点也较难(Eq. 2).mPEG-OH + BrCH2C0OCH2CH3BuLiSC-mPEG: mPEG- -0-mPEG-0OCH2C0OCH2CH3(1) NaOH_- mPEG- -OCH2C0OH (1)(2)HCT0虽然mPEC- -OH 与琥珀酸酐反应可以很容易地得到mPEG-- -0COCH2CH2C00H,但此分子中含有对酸和碱都不太mPEG-0-+ H2N-PeptidepH=g.稳定的酯键,,不适合用于固相多肽合成中.若通过mPEG-NH2与琥珀酸酐反应引人羧基得到mPEG- -NHCO-CH2CH2COOH,此类分子具有较好的稳定性,适用于固相多mPEG-0-C-HN-Peptide(2)肽合成中.mPEC--NH2可通过购买商品化试剂获得,也可以由mPEG- - OH作原料合成[8].在mPEC- -0CH2COOH 的合成1.2 赖氨酸铡链氨基的酰化修饰中应用了丁基锂,反应需在绝对无水条件下进行,而Lu等*川]报道以mPEC羧基衍生物修饰赖氨酸侧链氨基mPEG- -NHC0CH2CH2C0OH的合成比较容易些(Scheme 1).中国煤化工MYHCNMHG1322有机化学Val. 23. 2003得到Fmoc-Lys( mPFG- -0CH2CO)- -OH, 在固相多肽合成中将mPEG- -NH2 + Fmoc-Asp- -Bu-BOP其作为一个单体偶联到肽链中去，实现聚乙. _醇对肽链中特定赖氨酸侧链氨基的聚4二醇化修饰.也可以在固相合成过mosaP(mPFG- -NH)-OBu+ TFA。中用烯丙氧羰基(Aloc)保护特定位置的赖氨酸侧链氨基.肽FmoC-Asp(mPEG- -NH)-OH链组装完毕后先脱除Alloe,再将mPEG- 0CH2C00H 偶联到Scheme 3赖氨酸侧链氨基上去.然后经三氟乙酸裂解、RP-HPIC纯化可得到对肽链中特定赖氨酸侧链氨基进行聚4二醇化修饰3多肽和蛋白质中巯基的聚乙二醇化修饰方法的产物.此法适用于Fmxe固相多肽合成法中对赖氨酸的定点聚乙二醇化修饰(Scheme 2).Campbell等[3]在生长激素释放因子(GRF)类似物的C端引人半胱氨酸,在mPEG上引人巯基吡啶,然后通过.二硫键交换实现mPEG对CRF类似物C端的修饰(Eq.4).HOSu: HO-NPepide- -SI+ mPEG-S-p=4mPEG-OCH2COOH .HOSu/ DCCmPFG-OCH2COOSuPeptide--S-S- mPEG(4Fmoc-Lys- -OHFmoc-Lys (mPEG-0CH2CO)- -0HVanetswinkel 等141用定点突变法在蛋白质中引人半胱氨酸,以mPEG MAL作为聚乙二醇化试剂，通过蛋白质上的Scheme 2巯基加成到mPEC-MAL的双键上实现对蛋白质的定点修饰，此法已在许多蛋白质的聚乙二醇化修饰中取得了良好的效1.3 N端氨基的烷基化修饰.果15.161 .mPEC-MAL可通过商品化试剂买到,也可以用Kinstler等12用聚乙二醇的醛基衍生物(mPEG--CH0)mPEC- -NH2为原料合成[17].若在肽链中引入半胱氨酸,也可修饰rhG-CSF.反应在pH为5.0的水溶液中进行.活泼的醛以实现此类反应(Schene 4).基可将聚乙二醇偶联到蛋白质分子的氨基上,同时以氰基硼氢化钠作为还原剂实现稳定的烷基化修饰.此法具有较好的选择性,主要是修饰蛋白质的N末端氨基.其温和的反应条mPEG-MAL: CH20- (CH2CH20)= -CH2CH2 -N件适用于固相或液相多肽合成.此法若应用于多肽的N端.氨基修饰可能也会取得较好的效果(Eq.3).NaCNBH3ymPEG-C-H+ H2N-Protein(1) Maleic anhydridemPEG- -NH2(2)ACQONaOH mP:C-YmPEG- CH2- -HN- -Procin3)02多 肽链中羧基的聚乙二醇化修饰方法pH= 7-8mPEG-B + HS-PepideLu等!川以mPEC--NH2作原料修饰天冬氨酸侧链羧基得到Fmoc- Asp(mPEC- NH)一 OH,将其用到固相多肽合成中-S-Pepide实现聚乙二醇对肽链中天冬氨酸侧链羧基的修饰.也可以在mPEG一1合成过程中用烯丙基(Al]yl)保护特定位置的天冬氨酸侧链羧基,肽链组装完毕后在固相上先脱除Allyl,再将mPEC-NH2偶联到天冬氨酸侧链羧基上,实现对肽链中特定天冬氨Scheme 4酸侧链发基的聚乙二醇修饰.此法适用于Fmoe固相多肽合成法中对天冬氨酸或谷氨酸的定点聚乙二醇化修饰(Scheme4其它方法在固相多肽合成中,若先将Fmoc-NH- -PEG -C00H偶近年来,蛋白质的聚乙二醇化修饰方法发展很快,为多.联到树脂上，再合成肽链.最后用三氟乙酸裂解,可以实现肽肽的聚中国煤化工年。Wylie等8通过控链C末端羧基的聚乙二醇化修饰.制pH值CNMHG1质中的组氨酸侧链No.11王良友等:多肽和蛋白质的聚乙二醇化修饰方法1323的眯唑基. Satd191 用谷氨酰胺转氨酶( transglutaminase,Ishi. A.; Ueno, T. Prog. Polbm. Si. 1998, 23. 1233.TCGase)将mPFG-NH2转移到蛋白质的谷氨酰胺侧链上,实现Inada, Y.; Funukawa, M.; Sasaki, H.; Kodera. Y; Iliroto ,M; Nishimua, H.; Matsushina, A. Trends Bioterhnol. 1995,对谷氨酰胺的选择性修饰.借鉴这些方法.也有可能实现对肽链中组氨酸和谷氨酰胺侧链的选择性聚乙二醇化修饰13, 86.Kozloski, A.; Harris. J. M. J. Cortrouled Relese 2001. 72.(Eq. 5).217.6 Wang, Y. S.; Youngster, s; Crace, M; Bausch, J;mPFG-NH2 + R- -CONH2 Luas mPEG- -NHOC- -R (5) .Bordens, R.; Wyss, D. F. Adu. Drug Deliuery Rer. 2002, S4.547.lu, Y. A.; Felix, A. M. Pept. Res. 1993, 6. 140.5结束语8 Haris, J. M.; Struck, E. C.; (Case, M. C.: Paley. M. s. J.Poly. Sci.. Poly. Chem. Ed. 1984, 22, 341.随着蛋白质的聚乙二醇化修饰技术的迅速发展,肽类化9 Lee, K. C.; Morm. s. C.; Park, M.0.; Lee, J T: Na.合物的聚乙二醇化修饰研究越来越引人注目20).蛋白质的D. H.; Yoo, s. D.; lee, H. s.; DelLucd, P. P. Pharm.聚乙二醇化修饰几乎都在水溶液中进行,通过选择合适的聚Res. 99，16, 813.乙二醇化试剂或控制反应条件来实现定点、定量修饰.肽类10 Lee, H; Park, T. G. Pharm. Res. 2002, 19, 845.化合物的聚乙二醇化修饰可在固相载体上进行,此法易于实11 Lu.Y. A.; Feix, A. M. Imt. J. Pept. Prolein Res. 194.现对多肽链中某位点的选择性修饰,但固相合成反应速度43.127.慢,且随着聚乙二醇或多肽分子最增加，修饰难度增大;肽类12 Kinsler, 0. B.; Brems, D. N,; lauren, s. T; Paige, A. (.:Hamburger, J. B.; Treubeit, M. J. Pham. Res. 1996， I3,化合物的聚乙二醇化修饰也可以在水溶液中进行,可以实现分子量较大的聚乙二醇对分子量较大的多肽的修饰,但若有996.多个反应位点时产物分离及修饰位点的确定都有较大的难I3 Campbell, R. M; Heimer, E. P.; Ahmad, M.: Eiseubeis. H.G.; Lambros. T. J; Lee, Y.; Miller, R. w; Stnicker. P.度.多肽和蛋白质类化合物经聚乙二醇化修饰后具有降低免R.; Felixs, A. M.1. Pept. Res. 1997. 49, 527.疫原性增加水溶性、显薯延长其在生物体内的半衰期等优14 Varwetsewinkel, S.; Plaisance, S.; Zhang， Z.; Valinthour,点,但也可能因修饰而影响其与受体的结合,因此寻找合适1; Brepoels, K.; Lasters, 1; Collen, D.: Jespers, 1.. Blood的修饰位点,保持持续、有效的生物活性是多肽和蛋白质的2000, 95. 936.聚乙二醇化修饰研究的主要目的.多肽和蛋白质类药物的聚15 Goodson, R. J.; Katre, N. V. Bio/ Technologsy 1990. 8, 343.乙二醇化修饰研究有较好的应用前景.16 He, X. H.; Shaw, P. C.; Tam, S. C. lifeSri. 1999, 65.355.References17 Kogan, T. Symth. Commun. 1992, 22 , 2417.18 Wylie, D. C.; Voloch, M.; Lee, S.; liu, Y. H; Cannon-Zalipsky, s. Adu. Drug Delivery Rer.1995, 16, l57.Carlson, S.; Cutler, C.; Pramanik. B. Pharm. Res. 2001,? Roberts, M. J.; Bentley, M. D.; Haris, J. M. Adur. Dnug .I8, 1354.Delinery Rev. 2002, 54, 459.19 Salo, H. Adu. Drug Delinery Rev, 2002, 54, 487.3 Kodera, Y.; Matsushima, A.; Hiroto, M. ; Nishimura. H;20 Veronese, F. M. Biomaterials 2001, 22, 405.(Y0302262 QIN. x. Q.; UING, J.)中国煤化工MYHCNMHG