纤维素乙醇的研究进展

.24N1化学与生物工程纤维素乙醇的研究进展龚大春,田毅红,李德莹,龚美珍,涂志英三峡大学一艾伦·麦克德尔米德再生能源研究所,湖北宜昌443002)摘要:近年来以纤维素类生物质为原料制备乙醇的研究取得了许多进展,使纤维素乙醇的开发更具商业化前景。重点介绍了木质纤维素转化为乙醇的原料预处理方法、纤维素和半纤维素的酶法降解、有效可靠的发酵菌种的选育及木质纤维素乙醇制备工艺的开发关键词:木质纤维素;生物乙醇;进展中图分类号:TQ223.12TQ517.44文献标识码:A文章编号:1672-5425(2007)01-0004-0321世纪所面临的能源、资源、环境等危机,已成为进一步降低酶制剂的成本。人类文明发展的主要障碍。人们正在努力寻找替代化2.1产纤维素酶工程菌的构建石燃料的新能源,以降低对不可再生能源的依赖、控制利用基因工程方法可改善纤维素酶的性能、降低二氧化碳的排放、保护生态环境。纤维素原料是地球糖化生物质底物所需的酶量。对于纤维素酶工程菌最上产量最大的可再生资源,包括林木、农作物秸秆、农初的目标是纤维二糖酶,它们在天然纤维素酶系中副产品加工下脚料等,在自然生态系统的能量流与物般占60%~80%。 Teter等利用定点突变、定向饱质循环流中有重要地位,开发以木质纤维素为原料制和突变、PCR扩增和DNA分子进化,产生了里氏木酶备乙醇的工艺是未来乙醇生产的发展方向。的变种,突变株在酵母中表达,通过选育改善其热稳定作者在此重点阐述近几年有效的木质纤维素生物性和热活性。重组菌的综合性能超过母本,用于预处转化为乙醇的研究进展。在生物转化工艺中主要有三理后的玉米秸秆的水解。Day也利用定点突变,得步:纤维素预处理、纤维素酶解、酵母发酵及乙醇分离。到新的 Hypocreajecorena纤维二糖酶Cel7A(CBH1)变种,几个突变株表达在里氏木酶中显示出好的热稳1纤维素预处理工艺定性和可逆性。纤维素原料预处理方法主要有物理方法、化学方另一种方法是将异源酶引入里氏木酶系统中,加法、物理化学法和生物法。最有工业化前景的预处理方强整个体系的性能。 Bower介绍了将几个菌的内切法是物理化学法:低压氨爆和CO爆破。在蒸汽爆破酶引入里氏木酶的方法。从 Acidothermus cellulo过程中,纤维素结晶度和聚合度下降,细胞结构被破坏, anticus来的GH5A蛋白,被融合到里氏木酶的纤维二从而破坏纤维素一半纤维素一木质素的结构,半纤维素糖酶中,表达在里氏木酶中,发现在纤维素的糖化过程通过自水解作用转变成单糖和寡糖,部分木质素的B芳中具有更高的活性,结果显示6h达到20%的纤维素醚键断裂且发生部分缩合作用。由于化学方法涉及浓转化率,用母本的纤维素酶则需要10h酸、浓碱,对生物质的主要成分会有不同的影响。另外,2.2酶一底物相互作用机理的研究技术经济分析对主要的预处理方法进行原料成本评价碳水化合物键合的模型(CBMs)表明,通过和结和性能评价对工业化工艺的选择至关重要6。晶纤维素表面键合,靶向锁定特定底物的催化活性中2纤维素和半纤维素的酶法降解心,通过提高表面的有效浓度,可加强酶的催化活性同时有人认为酶的靶点在取向时,能裂解多糖的结构,近几年,从细菌和真菌里分离得到新的纤维素酶从而加和半纤维素酶。依靠基因工程、酶工程和发酵工艺将有效H中国煤化工 aje-Kolstad等提出CNMHG个小的非催化蛋白基金项目:湖北省教育厅重大项目(D200613006)收稿日期:2006-10-11作者简介:龚大春(1967—),男,湖北人,博士,副教授,硕士生导师,主要从事生物催化与生物转化领域的研究。 E-mail:dchgng2004@163.com。龚大春等:纤维素乙醇的研究进展/2007年第1期CBP21的存在。由于CBP21可以键合到结晶底物中,受木糖醇抑制,敲出醛还原酶基因(Gre3)是必要的导致底物的结构发生变化,从而提高了酶的水解能力。可以使从木酮糖到木糖醇的产量降到最低,获得更高2.3半纤维素酶的产率和速率。这些最新的研究结果显示利用重组酵半纤维素的有效降解需要许多酶的协同作用,最母改善木糖发酵已取得巨大进步。在国内,利用木糖重要的是半纤维素酶的参与。半纤维素酶的商业化开和葡萄糖的酵母工程菌的构建从2002年开始研究,其发远没有纤维素酶先进,因为目前纤维素乙醇的商业中山东大学曲音波教授和鲍晓明教授、大连理工大学化制备主要采用稀酸预处理生物质,而半纤维素在糖白凤武教授和中科院江宁硏究员做了大量工作。但国化之前就已去除。然而随着非酸预处理方法的开发,内对木糖代谢的下游疏通、辅酶工程和综合考虑代谢半纤维素还残留在紧密层,就要求半纤维素酶的参与。流提高乙醇总收率的研究还亟待加强目前从木酶得到的半纤维素酶活性较弱,不能完全转化为单糖。近年,通过了解木糖酶和半纤维素酶木质纤维素乙醇制备工艺的开发CBMs的特点,半纤维素酶的开发取得了不断的进纤维素乙醇的制备工艺主要有酸水解、酶水解乙展。开发低成本商业化的半纤维素酶和纤维素酶协同醇生产工艺两大类。目前酸水解工艺的研究较少,较作用,用于生物乙醇的生产,将是未来的研究重点酶水解工艺来说,其研究和发展潜力相对较弱,美国的己糖和戊糖共发酵工程菌的选育Vulcan化工公司和加拿大的 Stake公司已经完成了用木屑酸水解制备乙醇的全部设计工作。纤维素酶水以淀粉和蔗糖为原料生产乙醇的生物转化过程是解乙醇生产工艺可以分为分步水解发酵工艺、同步糖利用酿酒酵母。然而,从纤维素类生物质转化而来的化发酵工艺以及复合水解发酵工艺。糖不仅有己糖(主要是葡萄糖)·还有戊糖(主要是木4.1分步水解发酵工艺( Separate hydrolysis and fer糖)。大多数工业酿酒酵母菌株不能代谢木糖。针对 mentation,SHF这个难题,研究者们主要采用两种方法来提高从生物SHF法的工艺特点是纤维素水解和水解液乙醇质衍生的混合糖的发酵产率。第一种方法是通过基因发酵分别在不同的容器内进行,早期的纤维素酶水解工程和代谢工程的方法,将其它菌株的木糖代谢途径生产乙醇都采用这种工艺,其流程比较简单添加到酵母中。第二种方法是通过在微生物宿主细胞4.2同步糖化发酵工艺( Simultaneous saccharifica中利用基因工程同时表达能发酵己糖和木糖的基因, tion and fermentation,SSF)13构建工程菌,用于纤维素质的发酵。尽管目前两种方同步糖化发酵法是在酶水解糖化纤维素的同一容法均有较大进展,但对混合糖的利用率和产率还没有器中加入产生乙醇的纤维素发酵菌,使糖化产生的葡达到商业化的要求。另外,与从淀粉和蔗糖来的单萄糖和纤维二糖转化为乙醇。纤维素的酶水解糖化和葡萄糖相比,从生物质衍生的水解物中常含有不利于发酵过程在同一装置内连续进行,消除了底物葡萄糖发酵的抑制剂如醋酸、糠醛等,当浓度较高时,需要采浓度的增加对纤维素酶的反馈抑制作用。但SSF法用工艺除去或者开发超强菌株来解决这个难题也存在一些抑制因素,如木糖的抑制作用、糖化温度和在第一种方法中,木糖代谢基因已经表达到酵母发酵温度不协调等。消除木糖抑制的方法是利用能转中,酵母具有葡萄糖和木糖共发酵的能力。将毕赤酵化木糖为乙醇的菌株,如假丝酵母、管囊酵母等。硏究母 NADPH依赖的木糖还原酶和一个NAD依赖的较多的是利用葡萄糖与木糖的菌株混合发酵,与单纯木糖醇还原酶编码基因αXYL1,ⅩYL2)表达到酿酒酵的葡萄糖发酵菌和单纯的木糖发酵菌相比,混合发酵母中,并强化酵母内部的木酮糖激酶。通过添加木糖乙醇的产量分别提高30%~38%和10%~30%途径,在改进酵母性能的同时,这些重组菌中木糖发酵由同步糖化发酵法衍生出了很多类似的新工艺还受到氧化还原辅酶因子不平衡和ATP生成的限如同步糖化共发酵法( Simultaneous saccharification制。针对氧化还原不平衡,Bro等2提出了改变葡萄ndco中国煤化工固定化酶糖化发酵法糖到甘油路线的四条代谢途径,最终发现利用一个( ConsCN MH GBP)、非等温同步糖NADH氧化网络可将甘油产物替换为乙醇产物,解决化发酵法(NSSF)了基因工程菌构建后氧化还原辅酶不平衡的问题。第4.3复合水解发酵工艺( Multipl hydrolysis and fer种方法是用一个木糖异构酶表达在酵母中替代还原 mentation,MHF酶和脱氢酶,以避免氧化还原不平衡的问题。异构酶复合水解发酵工艺是将纤维素原料进行预处理龚大春等:纤维素乙醇的研究进展/2007年第1期后,半纤维素和纤维素分别进行发酵,所用的发酵方法究进展[冂].酿酒科技,2006,(8):97-100是多种方法的结合,如糖化时可以是酸处理和酶处理4潘亚杰,张雷,郭军,等农作物秸秆生物法降解的研究[J.可结合来完成,发酵时根据纤维素和半纤维素的性质也再生能源,2005,(3):33-355]罗鹏,刘忠,王高升.蒸汽爆破预处理条件对麦草生物转化为乙可采用不同的发酵方法相结合醇影响的研究[冂].酿酒科技,2005,(10):43-47.中科院生化工程国家重点实验室陈洪章等在6] Eggeman T., Elander R T. Process and economic analysis of分析了传统SSF法后,提出秸秆分层多级转化液体燃treatment technologies[J]. Bioresource Technology, 2005,96料的新构思,即以秸秆“组分分离、分级定向转化”为核(18):2019-2025心,将生物转化和热转化有机结合,多级转化生产燃料[7 Teter S, Cherry J. Ward C et al. Variants of cellobiohydrolase Ifrom Trichoderma reesei with improved properties [ P]. USP乙醇与生物油。秸秆经过不添加任何化学药品的低压2005048619爆破新技术处理后,采用高浓度发酵一分离乙醇耦合[8] Day A G. Novel variant Hypocrea jecorina CBH I cellulases,系统,可降低纤维素酶用量和费用,提高纤维素酶解效their production with recombinant cells, and their uses P]. USP率,简化操作过程,使蒸馏前乙醇质量分数超过60%,2004016760而且减少了发酵剩余物中的废水量9 Bower B S Fusion proteins of an exocellobiohydrolase and an en-doglucanase for use in the saccharification of cellulose and hem结语cellulose[ P]. USP 2005 093073[10 Vaaje-Kolstad G. Houston DR, Riemen A H K. et al. Crystal近几年来,木质纤维素转化为乙醇的研究取得了有cture and binding properties of the Serratia marcescens chi-意义的进展。建立可商业化的工艺的关键是降低每个tin-binding protein CBP21[J]. J Biol Chem, 2005, 280(12)单元操作的工艺成本和运行成本。通过对预处理工艺特点的深刻认识建立低成本的预处理工艺是纤维素乙1] Vardakou m,Fint1, Christakopoulos P.ta. A family1othermoascus aurantiacus xylanase utilizes arabinose decoration醇开发首先要解决的问题。然后利用蛋白质工程和基of xylan as significant substrate specificity determinants[JI因工程等技术有望进一步降低酶的成本,产生具有更好Mol biol.2005,352(5):1060-106特定活性的商业化酶。加强对半纤维素酶的应用基础12] Bro Christoffer, Regenberg birgitte, Forster Jochen. In silico ai-研究是一个重要方向。利用微生物代谢工程和基因工ded metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for程等手段进行商业化的混合糖发酵的酿酒酵母的选育duction[J]. Metabolic Engineering, 2006(2):102-111是纤维素乙醇开发的关键。最后,微生物转化为多种糖131 Kadar2s,sgd2z, Reczey K. Simultaneous saccharification再到乙醇的工艺也在不断改进之中。相信在不远的将and fermentation(SSF)of industrial wastes for the production o来会产生可与淀粉质乙醇媲美的低成本高产量的纤维ethanol [J]. Industrial Crops and Products, 2004,20(1):103素乙醇生产工艺,推动纤维素乙醇的产业化进程。参考文献[14] Ohgren Karin, Vehmaanper a Jari. Siika-Aho Matti, et al. High[1] Kotrba R. Keeping pace with policyLJ]. Ethanol Producer Magatemperature enzymatic prehydrolysis prior to simultaneous sac-charification and fermentation of steam pretreated corn stover for[2 Mosier N, Wyman C, Dale B, et al. Features of promising techethanol production[J. Enzyme and Microbial Technology, 2006nologies for pretreatment of lignocellulosic biomass [J].Biore-(in press)source Technology. 2005, 96(6):673-68615]陈洪章,徐建,姚建中,等.秸秆分层多级转化液体燃料新工艺文新亚,李燕松,张志鹏,等.酶解木质纤维素的预处理技术研的研究进展[].生物加工过程,2005,3(1):9-1Advances of research on bioethanol from ligncelluloseGONG Da-chun, tian Yi-hong, LI De-ying, GONG Mei-zhen, TU Zhi-ying(The Institute of Research on Renewable Energy of Three GorgesUniversity-Alan, G. Macdiarmid, Yich中国煤化工Abstract: Much advances of research on bioethanol from liCN MH Ge beeen made overpast few years, which make commercialization more promising. The pretreating methods, the enzymatic hydrolysis of cellulose and hemicellulose, the breeding of effective strains for fermentation, and the development of thegy for ligncellulose are mainly introducedKeywords: ligncellulose; bioethanol; advance