聚乙二醇不同修饰度对水蛭素活性和半衰期的影响

军事医学科学院院刊2005年8月第29卷第4期Bull Acad Mil Med Sci , Aug 2005 ; Vol 29 No4333聚乙二醇不同修饰度对水蛭素活性和半衰期的影响于爱平,刘玉英,蒋中华,董春娜,钟根深,吴祖泽(军事医学科学院放射医学研究所北京100850 )[摘要]目的通过优化聚乙二醇( PEG )对水蛭素的化学修饰反应条件得到具有生物学活性、半衰期延长的修饰产物。方法通过改变化学反应中聚乙二醇与水蛭素的比例获得不同修饰度的产物;采用SDS-PAGE分析产物的修饰度;TH发色底物法分析聚乙二醇修饰前、后水蛭素的活性;用凝胶过滤层析对水蛭素的PEG修饰产物进行分离纯化采用部分活化凝血酶时间( APTT )鉴定PEG修饰水蛭素在动物体内延长半衰期的效果。结果化学反应中PEG与水蛭素摩尔比超过3:1时水蛭素被修饰后抗凝活性明显下降。凝胶过滤层析方法分离得到不同修饰程度的水蛭素。活性分析表明连接1个和2个聚乙二醇分子的水蛭素保持了原有活性并可不同程度地延长体内半衰期连接3个以上PEG的水蛭素活性明显降低。结论通过控制PEG对水蛭素的修饰反应条件,得到了具有生物学活性、体内半衰期延长的修饰产物。[关键词] 水蛭素聚乙二醇化学修饰半衰期[中图分类号] R973.2[文献标识码]A[文章编号]1000-5501( 2005 )04-0333-04Effect of pegylation degree on activity and half-life of hirudinYU Ai-Ping ,LIU Yu-Ying ,JIANG Zhong-Hua , DONG Chun-Na , Zhong Gen-Shen , WU Chu-tse .( Institute of Radiation Medicine , Academy of Military Medical Sciences , Beiing 100850 ,China )[ Abstract ] Objective :To obtain the optimal reaction condition for pegylation of hirudin in order prolong half-life of hir-udin in vioo by pegylation. Methods : The pegylated products were isolated by gel filtration chromatography. Chromogenicsubstrate TH was used to analyze the special activity of hirudin with different pegylation degree. Activated partial thrombintime( APTT ) of rabbit serum was analyzed to identify the half-life of hirudin in rivo. Results :The activity of the pegylatedmixture decreased dramatically when the ratio of PEG us hirudin exceeded 3: 1. The activities of pegylated hirudins linkedwith 1 or 2 PEG were well retained but that with 3 PEG obviously attenuated. The half-lives of hirudins with different pegy-lated degree were prolonged to different extents. Conclusion : Under the optimization of modified conditions , two pegylatedhirudins with prolonged half life were obtained without activity loss.[ Key words ] hirudin ; polyethylene glycols ; chemical modification ; half-life随着生物技术的发展,蛋 白类药物的发展非常迅速,但不均一性产物的活性也随之不同。因此研究合适的修饰是其进入临床应用的速度和效果并不理想。其中重要的原反应条件和分离纯化方法得到活性较高的、能够延长体内因包括小分子蛋白类药物在体内的半衰期较短需要反复半衰期的蛋白修饰产物具有重要意义。注射或长时间滴注用药量大患者经济负担较重许多蛋白水蛭素( hirudin )是一相对分 子质量约7 x 10*的小分子类药物对于人体来说属于异源蛋白进入人体后容易引起免蛋白质,可以通过与凝血酶的特异性结合而直接抑制凝血酶疫反应。所以研发安全、长效的蛋白类药物的缓释、控释剂的活性被认为是-种新型的抗凝和抗栓药物用于血栓相型成为蛋白类药物发展的一个重要方向。采用一些高分子关性疾病的治疗和预防如冠状动脉成形术后再栓塞的治疗材料对蛋白质进行化学修饰是实现这一目标的重要手段之和预防、治疗急性心肌梗死和不稳定型心绞痛等3。但水蛭-。近年来聚乙二醇polyethylene glycol PEG )是被广泛用素在体内半衰期只有1 ~2 h临床用药量较大。用PEG对于蛋白类药物化学修饰的材料之一。PEG 修饰后的蛋白具水蛭中国煤化工半衰期降低用药量减少有不易被蛋白水解酶降解、不易被肾小球滤过等优点，从而用药CNMHG还可降低长时间大量给使蛋白修饰产物的体内半衰期延长。同时PEG对蛋白抗原表位的物理屏障作用使蛋白的免疫原性和抗原性下降或[收稿日期] 2004-12-27消除2。目前用于修饰蛋白的PEG的种类较多不同活化.[基金项目]国家973"计划基金资助项目( 2002CB713804 )形式的PEG对蛋白质的不同基团有一定的选 择性,但对蛋[作者简介]于爱平( 1972- )女山东省海阳市人在读博士白分子内同一种奥的多个基团的修饰具有随机性产物存在334军事医学科学院院刊2005年8月第29卷第4期药引发的免疫反应。M,(x103)4本研究旨在优化PEG修饰水蛭素的连接反应条件建53立反应产物的分离纯化方法探讨PEG修饰对水蛭素半衰36期的影响。体内外实验表明修饰产物的生物学活性得到了24保留,体内半衰期得到了延长。1材料与方法1.1 材料mPEG-SPA购自Shearwater 公司(相对分子质量5 x .103 ) ;水蛭素为本实验室提供纯度达95%以上凝胶过滤图1各 反应条件下PEG修饰水蛭素的SDS-PAGE层析介质Superdex 75购自Amersham公司;TH发色底物购1.蛋白相对分子质量标准2.水蛭素3. PEG:水蛭素=1:1 A. PEG:水蛭素=3:1 5. PEG:水蛭索=5:1 ;自Roche公司部分活化凝血酶时间( APTT )试剂盒购自太6. PEC:水蛭素=10:1阳生物技术公司其他药品为分析纯;所有水溶液均用Milli-pore超纯水系统生产的超纯水配制。1.2 mPEG-SPA 偶联水蛭素的反应表1不同反应 条件下各产物的比活性分析水蛭素溶于硼酸缓冲液( pH 9.0 )中,分别按mPEG-PEG:水蛭素比活性<( ATU/mg水蛭素)SPA:水蛭素摩尔比1:1 3:1 5:1和10: 1的比例称取mPEG-10:1686SPA室温搅拌反应1 h。5:11 0771.3 SDS-PAGE3:110 102参照文献4 ],15%的分离胶5%积层胶采用氯化钡.1:117 348和碘液对PEG进行染色水洗后再对蛋白进行考马斯亮蓝水蛭素17 339染色。1.4 活性测定参照文献5]采用TH发色底物法。31.5 凝胶过滤层析2取水蛭素: mPEG-SPA摩尔比1:1的反应产物上凝胶过滤层析柱(Superdex75,2.6cmx90cm),洗脱液为0.05mol/L的磷酸缓冲液pH7.0流速为2ml/min检测波S长为214 nm。当客米1.6 动物体内半衰期实验雄性新西兰大白兔,体重2.5~3 kg按水蛭素1 mg/kg体重耳缘静脉给药在给药前给药后10 min 30 min 1.5 h,2.5h3.5h和4.5h股静脉取血0.109mol/L枸橼酸钠抗020406080100120140160凝离心取血浆按试剂盒说明测部分活化凝血酶时间。洗脱时间(t/min)2结果图2凝胶过滤层析图( pH =9.0 PEG:水蛭素=1:1 )2.1反应产物的电泳分析1. PEG3-水蛭素2. PEG2-水蛭素3. PEG1-水蛭素4.水蛭素;取各反应产物进行SDS-PAGE结果见图1。由图中可5.琥珀酰亚胺等小分子看出每种反应条件下的产物均为多个组分的混合物按每56分子水蛭素连接PEG数目的多少分别记为:PEG1-水蛭素,PEG2-水蛭素,PEG3-水蛭素,PEG4-水蛭素和PEG5-水蛭素。M,(.x 103)本文采用的氯化钡和碘液染色方法是专-对PEG进行染色着色深浅与PEG的量呈正相关而与蛋白量无关。24 -2.2 反应产物的活性分析以原料水蛭素为对照对各反应条件下的修饰产物按等中国煤化工摩尔数进行比活性分析结果见表1。MYHCNMHG2.3 凝胶过滤层析及各组分活性分析由表1看出反应中mPEG-SPA与水蛭素摩尔比为1:1图3凝胶过滤 层析各洗脱峰SDS-PAGE的修饰产物活性保持良好,因此取该产物上Superdex 75柱,1. 蛋白相对分子质量标准2.水蛭素3. PEG:水蛭素色谱图见图2、盆别收集各洗脱峰进行SDS-PAGE和活性分=1:1反应产物斗洗脱峰3 5.洗脱峰2 B.洗脱峰1析结果分别见图3和表2。第4期于爱平等.聚乙二醇不同修饰度对水蛭素活性和半衰期的影响335表2凝胶过滤层析各 洗脱峰比活性分析481.28%分离组分比活性( ATU/mg水蛭素)PEG3-水蛭素5 85012.0PEG2-水蛭素17 908PEG1-水蛭素17 3008.2水蛭素17 4546.1 11.17%2.75% .4.8%由各组分的SDS-PAGE结果和活性分析表明峰1、2.3、2.0火4分别是连接3.2.1个PEG分子的水蛭素和反应中剩余的0.水蛭素峰5既无抗凝活性在蛋白电泳中也未见染色可能100.0120.0140.160.0是反应中产生的琥珀酰亚胺等小分子物质。各组分活性测t/min定结果表明PEG2-水蛭素和PEG1-水蛭素活性保持较好而图5凝胶过滤层析图( pH7.5 PEG: 水蛭素=1:1 )PEG3-水蛭素活性明显下降。1. PEG3-水蛭素2. PEG2-水蛭素3. PEG1-水蛭素A.水蛭素2.4动物体内半衰期实验结果由于PEG3-水蛭素的活性明显降低所以只取PEG2-x<蛭素和PEG1-水蛭素进行动物实验考察了水蛭素及其PEG56. 89%修饰产物对APTT的影响。与水蛭素相比,PEG1-水蛭素和PEG2-水蛭素可不同程度地使APTT延长当水蛭素组APTT27.67%10.0恢复至基础值后,PEG1-水蛭素组和PEG2-水蛭素组APTT8.0.仍分别为基础值的1.4倍和1.6倍这表明这两种修饰产物6.0|的体内半衰期得到不同程度的延长。结果见图4。4.0-◆-.水蛭素1.13%250-部PEG1-水蛭素).0 |-▲PEG2-水蛭素-2.0100120140160180图6凝胶过滤层析图( pH9.0 PEG:水蛭素=0.5:1 )501. PEG3-水蛭素2. PEG2-水蛭素3. PEG1-水蛭素4水蛭素50 100 150 200 250 300本研究中的重组水蛭素2其N端是抗凝活性功能区，为其活性所必需水蛭素分子有6个半胱氨酸残基,形成3图4 PEG 修饰水蛭索对APTT的影响对二硫键;每分子水蛭素中共有4个赖氨酸,分别位于24、27.35和47位其中47位赖氨酸对维持其空间构象具有重2.5 PEG偶联反应条件的优化要意义[8。因此我们选择了专-修饰赖氨酸侧链氨基的活由于PEG1_水蛭素和PEG2-水蛭素较好地保持了原有.化PEC mPEG-SPA )与水蛭素偶联尽管该种PEG对赖氨酸活性并可延长水蛭素的体内半衰期,因此提高PEG1-水蛭侧链氨基有-定的选择性,但当PEG过量时少量的PEG仍素和PEG2-水蛭素的转化率降低PEG3-水蛭素的产率具有可与末端氨基发生偶联。为得到有活性的PEG修饰产物,重要意义。研究表明减少PEG与蛋白的比例以及降低反本实验对偶联反应条件进行了较为系统研究,反应中PEG应的pH可降低PEG的偶联率(0]。为此我们对偶联反应的的用量可明显影响其产物活性。当PEG用量增加( PEG与条件进行了如下改变:①反应中PEG与水蛭素摩尔比保持水蛭素摩尔比>3: 1 )时产物活性明显下降。主要原因是水1:1 而pH降至7.5②反应中pH保持9.0 ,PEG与水蛭素蛭素的修饰度随反应中PEG的比例增加而增加,水蛭素是摩尔比降至0.5:1。反应产物上Superdex75柱进行凝胶过小分子蛋白偶联过多的PEG分子可能物理性遮蔽水蛭素滤层析结果分别见图5和图6。的活性区影响与凝血酶的结合表现为水蛭素活性下降其次随着被pEC偶联的赖氣酸数日的增多，越来越多的水蛭3讨论素的中国煤化工政其空间构象不稳定或发目前用于修饰蛋白质的活化PEG种类较多,可以根据生改YHCN MH G可能随着PEC的增多赖蛋白质本身的特点和要求选择不同种类的活化PEG例如,氨酸侧链氨基逐渐被PEG偶联饱和后,PEG 可能会与N端专-性修饰肽链的N端氨基半胱氨酸的巯基赖氨酸的侧的a-氨基发生偶联使其活性丧失。链氨基等7。所选择被修饰的基团必须是蛋白质功能的非为进-步研究偶联PEG的数目对水蛭素活性的影响，必需基团唇厕轉專致蛋白质活性下降甚至完全丧失。我们采用凝胶过滤层析的方法对保持了原有活性的反应产336军事医学科学院院刊2005年8月第29卷 第4期物PEG:水蛭素为1:1 )进行了分离纯化得到了3种修饰.[参考文献 ]度的产物其中PEG1-水蛭素和PEC2 -水蛭素较好地保持了原有活性而PEG3-水蛭素活性明显下降。通过降低反应的[1 ] Nakaoka R ,Tabata Y ,Yamaoka T ,et al. Prolongation of the ser-pH值偶联率显著降低，未发生偶联的水蛭素占81. 28% ,um half-life period of superoxide dismutase by poly( ethylene gly反应产物中PEG3-水蛭素的量相对增多而PEG1 _水蛭素和col ) modifcaio[ J ].J Control Release ,1997 A6(3 ) 253 -261.PEG2-水蛭素的量相对减少其原因可能是随着pH的降低，[ 2 ] Katre NV. Immunogenicity of recombinant IL-2 modified by cova-lent atachment of polyethylene gyco[ J ] J Immunol ,1990 ,144mPEG-SPA的水解增加,而氨解的选择性降低。通过降低反(1) 209 -213.应中PEG的相对用量明显降低了产物中PEG3-水蛭素的含I 3 ] Glusa E. Pharmacology and therapeutie applications of hirudins a量,PEG1-水蛭素和PEG2-水蛭素的含量相对增高。尽管由new anticoagulan[ J] Kidney Int Suppl ,1998 64 :s54 -56.于反应中PEG量的减少水蛭素的转化率降低(剩余水蛭素[4 ] Kurfirst MM. Detection and molecular weight占50%以上)但这些水蛭素可回收再利用。因此,我们在lyethylene glycol-modifed hirudin by staining after sodium dodecyl减少PEG用量的基础上使PEG1-水蛭素和PEG2水蛭素的sulfate-polyaerylamide gel electrophoresis[ J ] Anal Biochem ,相对转化率得到了提高,降低了产物中PEG3-水蛭素的含1992 200(2)244 -248.量。[5 ] Griessbach U , Surebecher J , Markwardt F. Assay of hirudin in在保证水蛭素原有活性的前提下延长修饰产物的半衰plasma using a chromnogenie thrombin substate[ J ] Thromb Res期是本研究的重要目的之- -。有研究表明反映抗凝效果的1985 37(2 ) 347 -350.常用生化指标中凝血酶原时间(PT)因对水蛭素浓度变化[6] ZalipskyS ,lee C. Poly( ethylene glycol ) chemisty : bitechnics不敏感不能很好地反映水蛭素在体内的代谢情况;而凝血and ppication[ M] Harris JM ,Ed. NY :Plenum , 1992.酶时间( TT )对其变化又过于敏感其线性变化区域很窄;[7] Roberts MJ ,Bentley MD ,Haris JM. Chemistry for peptide andprotein pegylatior[ J] Adv Drug Deliv Rev 2002 ,54( 4 ) :459 -APTT能在较宽范围内反映水蛭素的代谢状况线性关系较476.好9]。因此我们选用检测给药后APTT的变化作为反映体8] Rydel TJ ,Tulinsky A , Bode W. Refined structure of the hirudin-内水蛭素半衰期变化的指标。thrombin comple[J]. J Mol Biol ,1991 221(2 ) 583 -601.本研究表明,PEC1-水蛭素和PEC2-水蛭素可不同程度[9] Schenk JF , Glusa E , Radziwon P ,et al. A recombinant hirudin地延长水蛭素在体内的有效作用时间其体内半衰期较水蛭( IK-HIR02 ) in healthy vlunteers. I. Effects on coagulation parame-素有所延长并且通过反应条件的优化提高了PEG1-水蛭ters and bleeding time[ J ]. Haemostasis ,996 2(3 ) 140 - 149.素和PEG2-水蛭素的转化率。由此我们得到了活性保持良(本文编辑 姜晓舜)好、半衰期延长的PEG修饰的水蛭素产品使其有可能成为一种新的抗凝药物的缓释剂。(上接第308页)lated protein-1 in cultured osteoblast[ J ] Endocrinology , 1999[ 20] Ellis MJ , Jenkins S , Hanfelt J ,et al. Insulin-like growth factors140( 1 )228 -232.in human breast cancer[ J ]. Breast Cancer Res Treat ,1998 ,52[25 ] Ahmed S , Yamamoto K ,Sato Y , et al. Proteolytic processing of( 1-3):175 - 184.ICFBP-related protein-1 ( TAF/ angiomodulin/ mac25 ) modulates[21] Hu YF ,MiyakeT ,YeQ et al. Characterization of a novel trans-its biological activity[ J ] Biochem Biophys Res Commun 2003 ,activation domain of BRCA1 that functions in concert with the310(2) 612 -618.BRCAI C.temina( BRCT ) domair{J] J Biol Chem ,0000 ，[26] Wixlerv ,Gets D，aplatine E ,e al. The LM-oly protein275( 52 ) :40910 - 40915.DRAL/FHL2 binds to the cytoplasmic domain of several alpha[22] 丁丽华张京生周围等胰岛素样生长因子结合蛋白-7and beta integrin chains and is recruited to adhesion complexes基因的克隆和表达[ J ]生物技术通讯2003 ,14( 4 ) 282 -[ J]J Biol Chem ,2000 ,275( 43 ):33669 - 33678.284.[27] Wilson EM ,0h Y ,Hwa V ,et al. Interaction of ICF-binding pro-[23] Oh Y , Nagalla SR , Yamanaka Y ,et al. Synthesis and character-tein- related protein 1 with a novel protein , neuroendocrine diferization of insulin-like growth facto-binding protein( ICFBP )-7.15 1110 F--berinol Metab ,2001 , 86( 9 ):Recombinant human mac25 protein secifcally binds IGF- I中国煤化工and - I[ J]J Biol Chem , 1996 271( 48 ) :30322 - 30325.[24 ] Pereira RC , Blanquaert F , Canalis E. Cortisol enhances the ex-MHCNMH G(本文编辑孙承媛)pression of mac25/ insulin-like growth factor-binding protein-re-