聚乙二醇修饰重组人生长激素的初步研究

第21卷第2期生物学杂志Vol.21 No.22004 年4月JOURNAL OF BIOLOGYApr ,2004文章编号: 1008 - 9632(2004)02 - 0020- 03聚乙二醇修饰重组人生长激素的初步研究王荣海' ,魏练平2 ,戎隆富',宋礼华'(1.安徽省生物研究所,合肥230088;2.安徽大学生命科学学院,合肥230039)摘要:目的探讨聚 乙二醇(MW20kD)修饰重组人生长激素(GH)的反应条件以及修饰产物的纯化方法。方法在不同条件下,将聚乙二醇活性酯与hGH反应,以单个PEG- GH的比例为指标,用SDS- PACE和薄层扫描方法,确定其在反应产物中所占的比例;采用CM - Sepharose F离子交换和Sephacry IS- 200分子筛凝胶层析法对修饰产物进行分离纯化。结果聚乙二醇修 饰rhGH的反应条件为pH8.0、rbGH与聚乙二醇的比例1:2(mg:mg)反应时间2.0h;反应产物经两步纯化,所得的单个PEG- GH纯度大于95%。结论初步确定了 聚乙二醇修饰hCH的反应条件和修饰产物的纯化方法。关键词:重组人生长激素(hGH);聚乙二醇(MW20kD);化学修饰中图分类号:Q575*11文献标识码:A重组人生长激素(hCH)具有调节代谢、刺激蛋白所);DYY- I型电泳仪(北京六一仪器厂);薄层扫描质合成和加速脂肪降解等生理功能,能促进骨骼和肌仪( Phamacia Biotech公司产品);LC - 10AD高效液相肉组织的生长发育,是目前治疗儿童因内源性生长激色谱(岛津公司产品)。素缺乏或不足导致的身材矮小的特效药。又因能促1.2 方法进伤口的愈合,也用于损伤、严重烧伤的治疗和外科1.2.1单甲 氧基聚乙二醇( mPEG, MW20kD)活性酯手术中。由于它是蛋白质,受体液中酶的隆解和肾脏的合成及性质鉴定活性酯的合 成按文献方法进的排泄,在体循环中半衰期较短,需要长期注射才能行[2-3] ,最终产物经冷冻干燥保存。采用红外光谱法维持疗效。聚乙二醇(PEG)是一种无毒、无免疫原性和核磁共振('H - NMR, CDCl3)法测定PEG活性酯中的水溶性高分子物质,可以通过共价结合方式修饰蛋相关基团的特征吸收峰。另取mPEG活性酯0. 5mg,白质,延长蛋白质分子在体内循环半衰期。利用低分溶于200μ1超纯水中,用分子筛HPLC鉴定产物纯度,子量的PEG( MW5kD)修饰rhGH已有文献报道[1],本检测波长为254nm。研究采用分子量为20kD的PEG修饰tGH,进行了，1.2.2 PEG 修饰rhGH反应pH的筛选取 rhGH冻PEG活性酯合成、修饰条件筛选、修饰产物分离纯化干粉,分别用20mml.L-1 pH6.0,7.0,8.0,9.0的磷酸等研究。盐缓冲液,按hCH: PEG = 1:2(mg: mg)比例加入PEG1材料与方法活性酯,室温反应2.0h。取样作SDS - PAGE(浓缩胶1.1 材料5% ,分离胶15%),考马斯亮蓝#R-250染色。电泳tCH半成品,浓度为9.5mgml-' ,经冷冻干燥后保胶用薄层扫描仪扫描。存备用,安徽安科生物工程股份有限公司产品;单甲1.2.3.修饰反应时间的筛选取thGH冻干粉,溶于氧基聚乙二醇( mPEG, MW20kD)购于Sigma公司;CM20mmol. L-',pH8.0 PB溶液中,按rhGH: PEG= 1:2- Sepharose FF和Sephacryl S- 200为Phammacia 公司(mg:mg)的比例加入PEG活性酯,室温反应,反应时产品。.间分别为0.5,1.0,1.5,2.0,4.0h,每个时间点取样,8823A-紫外检测仪(北京市新技术应用研究立即用冰乙酸终止反应,作SDS- PAGE,染色,电泳胶中国煤化工收稿日期:2003- 12-05作者简介:王荣海,男.副研究员,硕士研究生导师。MHCNMHG基金项目:2001 ~ 2002年度安徽省优秀青年科技基金资助(编号26)20第21卷第2期生物学杂志Vol.21 No.22004 年4月JOURNAL OF BIOLOGYApr,2004用薄层扫描仪扫描。的PBS,收集洗脱峰, SDS - PAGE鉴定。1.2.4 PEG 活性酯投料比的筛选取rhCH冻干粉1.2.6 纯化产物的纯度检定 用SDS - PACE法进溶于20mmol. L-',pH8.0 PB溶液中,按hGH: PEG活行,电泳胶用薄层扫描仪扫描。性酯(mg:mg)分别为1:0.5,1:1,1:2,1:3,1:4,1:6,1:2结果8,1:10的比例投料,室温反应,反应时间2.Oh,冰乙2.1 PEG 活性酯的合成酸终止反应,作SDS - PAGE,染色,电泳胶用薄层扫描合成的PEG活性酯,经红外光谱测定,有如下特仪扫描。征峰:1934(C= 0,琥珀酰亚胺);1734(C=0,羧基);. 1.2.5 修饰产物的纯化 按选定的反应条件,将1112(CH20CH2);经核磁共振光谱('H - NMR, CDCI3)PEG活性酯与thGH室温反应,用冰乙酸终止反应,反测定,有如下特征峰:4.2(m, 4H, CH20CH2);3. 61(s, .应液用20mmol. L-', pH5.0的NaAC- HAc缓冲液稀- 500H, PEG);2.58(s, 8H, CH2C=0),可以确定合成释1倍,上CM-SepharoseFF柱,将柱充分平衡洗涤的PEG活性酯为ss - PEG,即单甲氧基聚乙二醇琥珀后,用250mmol. L-I NaC, NaAC - HAC pH5.0缓冲液酰亚胺琥珀酸酯。PEG活性酯经分子筛HPLC鉴定，洗脱,收集洗脱峰,浓缩。浓缩液上Sephacryl S- 200为单一峰,未见其它杂峰。柱,柱体积2.6 x 100cm,流动相为20mmol.L-1 ,pH7.42.2修饰反应的条件KD97.466●662一43.043031.05291--20.12011234567團1不同pH条件对PEC修饰tICH的影响围2不同反应时间对PEC修饰dGH的影响Fig# 1.Non.rdhued SDS-PAGE(15% I pruliles ter uhCHFg# 2,Ner rdued SDS PAGE(15%) preilea for d.CHmodibed by PEG略diferen pHmolifed by PEC t difee macticn time1.p19.0 2.pH8.0 3.pH7.01. sandard marker 2.MCH 3.0.5h4.pl6.0 S.ICH 6.standarde murker4.1.0h 5.1.5h 6.2.0h 7.4.0h97414412345678923图3不同PEG投料比PEG修饰hGH的影响圄4 mPEG CH纯度检定Fig# 3.Non-reduced SDS-PACE(15%) proiles for hCHmodifed by PEG a dferent mss ratioesFig# 4. Reducedl SDS-PAGE(15% ) profiles for purified mPEC-GH1. rhGH 2.1:0.5 3.1:1 4.1:2 5.1:31. standard manker 2. rhGH 3. mPEG-CH.1:4 7.1;6 8.1:8 9.1:10在本实验条件下,PEG与hCH发生反应后的产接-中国煤化工带及相对分子质量大物,经SDS - PAGE,主要出现分子质量22kD的未修饰于5HCNM H G条带。其中分子质量的rhGH条带、相对分子质量57kD每个hGH分子连57KD的单个PEG - GH为研究的目标产物。在选定21第21卷第2期生物学杂志Vol.21 No.22004年4月. JOURNAL OF BIOLOGYApr,2004修饰反应条件时,以单个PEG-GH在修饰产物中所(见图4)。占的比例高低作为指标。试验结果表明，在pH6. 0, .3讨论.7.0,8.0,9.0的条件下,单个PEG - CH所占的比例分rhGH在临床上主要用于治疗儿童因内源性CH别为17. 9%、36.2% .46.0%、22.8%。其中以pH8.0缺乏所导致的身材矮小症。由于在体内的半衰期短,时PEG-GH所占的比例最高。当pH为9.0时,修饰为了达到疗效,需要每日注射,一个疗程需要注射180效率和单个PEG - GH所占的比例下降(见图1)。反次,患儿非常痛苦。利用PEG对其进行修饰,可以延应时间从0.5,1.0,1.5,2.0,4.0h,单个PEG- GH所长体内半衰期。有研究表明,在分子质量15KD至占的比例分别为36. 8%、40.2%、43. 0%、45. 9%、70KD的范围内,肾脏清除小分子蛋白质的速率与相39.0%。反应时间2.Oh时,单个PEG-GH所占的比.对分子质量大小呈负相关[4]。随着用于修饰的PEG例最高。当反应时间大于2.0h时,单个PEG - GH在.的增大,蛋白质分子通过肾脏的排泄减少,在体内的整个修饰产物中所占的比例下降,分子质量大于半衰期延长。为此,我们采用20KD的PEG对rhCH57KD的多个PEG - CH的比例增加(见图2)。PEG活进行修饰。性酯的投料比对修饰反应影响较为显著,在hGH:利用20KD的mPEG,合成ss - PEG修饰rhGH, 当PEG活性酯(mg:mg)的投料比1:0.5,1:1,1:2,1:3,1:pH值为9.0时,修饰效率和目标产物的比例下降明4,1:6,1;8,1:10的情况下，单个PEG- GH所占的比显,这主要是ss - PEG活性酯在高pH的情况下易产例分别为30. 1%、42.4%、46.2%、44. 9%、43.4%、生降解所致。我们另发现,将纯化的单个PEG - GH40.5%、41.4%、35.2% ,多个PEG - GH的比例分别为的pH调至9.0时,原来连接于rhCH上的PEG会分解3.6%、7.2%、15. 0%、16. 3%、17. 2%、20. 0%、脱落。PEG与CH的投料比对反应的影响最为显著,18.8%、19.4% ,投料比为1:2时,单PEG- GH所占的随着PEG量的增加,修饰比例增高,当投料比超过1:比例最高(%) ,随着PEG量的增加，单个PEG- GH所2时,多个PEG - CH增加非常明显,这为后一步产物占的比例增加降低,多个PEG-GH的量则增加明显的纯化会带来困难。在纯化进程中,由于PEG为线性(见图3)。根据实验结果,选择rhGH: PEG活性酯分子,而rhGH为球形分子,当两者共价结合形成PEG(mg:mg)的投料比1:2, pH8.0,反应时间2.0h作为-GH后,行为发生了改变,使修饰产物的分离变得困PEG修饰hCH的反应条件。难。2.3修饰产 物的纯化根据选定的条件,用PEG活性酯对rhGH进行修参考文献:饰,终止反应,修饰产物稀释后上CM - Sepharose FF[1] Ross C, Kenneth 0, Germaine F. Long acting growth hormones离子交换柱,其中未反应的PEG和部分多个PEG -produced by conjugation with polyethylene gycol [J].J BiolChem, 1996,271 :21969.GH不被吸附而在穿柱中出现。经过洗涤平衡后可以[2]Zalipsky s,Gilon C, Zilkha A. Attachment of dnugs to polyethylene将未反应的PEG完全除去。用250mmol. L-1 NaCl,glycols[J]. Eur Palym J, 1983, 19:1177.NaAC-HAc洗脱,所出现的洗脱峰中,主要成分为单[3]Kodera Y, Matsushima A, Hiroto M, et al. Regulation of proteins个PEC-GH,另有少量多个PEG-GH和未反应的and bioactive substances for medical and technical applicationGH。将此洗脱产物浓缩后,SephacrylS-200分子筛[J].J Prog polymer Sai;1998,23:1233.柱,可以除去多个PEG - GH和未反应的CH。收集的[4] Feency RE. Chemical mdifcation of proteins: comments and主峰,经SDS- PAGE检定,显示单一条带,即单个perspectives[J]. Int Pep Prolein Res ,1987 ,29:145.PEG - GH。电泳胶用薄层扫描仪扫描,纯度大于95%[5]田泫 ,姚文兵,吴梧棚,等.对干扰素a- 2b的初步化学修饰研究[J].中国药科大学学报,2000,31(1):74.Chemical modification of rhGH with activated polyethlene glycolWANG Rong-hail , WEI Lian-ping2 ,R中国煤化工i-hua'(1. Anhui Biological Institute, Hefei,2300CNMH G .2. School of Life Science, Anhui University, sdcs ,2wJJ , cuis,uiua,(下转27页)22第21卷第2期生物学杂志Vol.21 No.22004年4月JOURNAL OF BIOLOGYApr,2004MSCs;(3)用细胞刮收集细胞时可以直接挑选,得到的参考文献:MSCs纯度高;(4)纯化后的培养中加人- -定量生长因[1] Friedenstein AJ, Chailakhyan RK, Gerasimov UV. Bone marow子是必要的,否则会有一个缓慢的增殖期。osteogenic stem cells: inviro culivation and transplantation indifusion chambers[J]. Cell Tissue Kinet, 1987 ,20;263 ~ 272.到目前为止,MSCs还没有特别的鉴定方法,主要[2]路艳蒙,傅文玉,朴英杰.大鼠间充质干细胞的培养[].解根据其形态特点和贴壁特点鉴别。我们采用上述方法,所得MSCs贴附于培养皿度,细胞呈梭形,似成纤剖学杂志,000,23:160[3]Huang sC, Chen NJ,Hsich sL, e al. lsolation and characterization维样细胞,培养的MSCs可进行消化、传代和冻存。of size sieved stem cells from human bone marow[J]. Stem cellsMSCs体外培养可自然分化为成骨细胞。由于2002;20:249 ~ 258.MSCs常作为-种实验工具,维持其长期增殖而不自[4] Deryugina E, Mulr-Sieburg CE. Stromal cells in longem然分化是很必要的,这方面的工作我们正在进- -步 的cultures: keys to the elucidation of hematopoietic development研究中。[J].Cit Rev lmmunol, 1993, 13,115~ 150.Preparation and culture of murine bone marrow stromal stem cdllsRUAN Xu-zhil CHEN Xia-ping2 YAN Shi- rong' W ang Wei-min2(1.The Biology Teaching and Research Office, Yunyang Medical College , Shiyan, 442000;2. Intiute ofLife Science, Yunyang Medical College Attached Tai-He Hospital, Shiyan, 442000; 3. The BiochemistryTeaching and Research Office, Yunyang Medical College, Shiyan, 42000, Hubei ,China)Abstract: A method for isolating and culturing mouse bone marrow-detived mesenchymal stem cells ( mMSCs) wereestablished. MSCs were isolated from mouse thighbone marrow and cultured in Dulbecco' s modifed eagle' s medium with lowglucose and purified by wllsticking and colonies collection, and were prolferated through subculuring by adding epidermalgrowth factor (EGF) and pletelet-derived growth factor( PDGF - BB) .Cellular proliferation were observed and recorded underthe inverted microscope. Puifed MSCs were acquired and became fibroblast-like. EGF and PDCF-BB were efective agentsfor mMSCs proliferation in vitro.Key words: murine ; bone marrow stromal; stem cells; cell culture.(上接22页)Abstract: The optimal reaction conditin of modifying hGH by activated polyethylene glycol (PEC) with relativemolecular weights of 20kD and the separation methods of the reaction mixture were studied . rhGH was modified with activatedPEG under various conditions, the ratio of mono-mPET-GH was determined by SDS-PAEG and thin layer scanning. Thereaction mixture was purified by ion- exchange and molecular size exclusion chromatography . The optimal reaction was pH8.0,1:2 for the mass ratio of rhGHand PEG, two hours for reaction time was selected. The punity of mono mPEG-GH isolated byion-exchange and molecular size exclusion chromatography was higher than95% .Key words: rhGH; polyethylene glycol( MW20kD) ; chemical moldifcation中国煤化工MYHCNMHG27