苦瓜抗HIV活性蛋白及其聚乙二醇修饰研究进展

综述生命科学仪器2009 第7卷/10月刊苦瓜抗HIV活性蛋白及其聚乙二醇修饰研究进展屈默龙 刘鑫(四川大学生命科学学院610064 )摘要苦瓜籽含有许多具有抗HIV活性的核糖体失活蛋白，例如a-苦瓜素，β -苦瓜素和MAP30,它们还分别具有随胎、抗肿瘤活性、抗乙肝病毒活性等。本文从结构、功能、抗HIV分子机制、与其它病毒作用、与其它药物相互作用等方面总结了MAP30蛋白的研究,并根据现有的聚乙二醇修饰方法对MAP30修饰研究提出了展望。关键词核糖体失活蛋白苦瓜素, MAP30,人免疫缺陷病毒，聚乙二醇苦瓜(Momordica charatia L)是葫芦科年攀援草本型RIP由一条多肽链组成，碱性糖蛋白，等电点在苦瓜属植物，果实性寒味苦,具有清热解毒、滋养强8~10之间，具有RNAN-糖苷酶(RNAN-glycosidase,壮等功效。苦瓜中有多种化学物质,如momorcharins,RNG)的活性; I型RIP由分子量相近的A、B两条.momordenol,momordicilin, momordicins, momordicinin,多肽链通过一对二硫键相连,并通过强烈的疏水作用momnordin,momordolol等1"。本文将介绍其中抗HIV活结合在- -起，等电点在6~8之间。其中A链和I型性的蛋白。RIP-样具有RNAN-糖苷酶活性; B链是一个对半乳糖专- -的凝集素,能介导A链进人细胞发挥作用。1.苦瓜素现有研究表明，MAP30可以特异地抑制受病毒感染a苦瓜素和β苦瓜素可以抑制HIV-2整合酶,对的细胞和肿瘤转化细胞，诱发其凋亡，但对正常细.疱疹病毒、HIV、柯萨奇病毒、脊髓灰质炎病毒都具胞却没有毒副作用，显示了巨大的临床应用价值。有体外抗病毒活性,抑制鸟苷酸环化酶相关的发病机2.1. MAP30 的结构理，抑制白血病等癌症。a苦瓜素对子宫内膜的分化MAP30基因没有内含子,全长861 bp,编码286有抑制作用,因此还具有堕胎功能,对绒毛膜癌和黑个氨基酸,其中包括N端23个氨基酸的引导肽。成熟素瘤细胞具有毒性,可增强小鼠巨噬细胞的杀伤肿瘤的MAP30蛋白为263个氨基酸，其51 ~ 53位的Asn-效果。β苦瓜素可以抑制假孕鼠子宫蜕膜化和内膜、Leu-Thr是N连接糖基化位点。另外，MAP30含有肌瘤细胞的增殖,也可抑制培养的子宫内膜细胞的生特定的Trp)9和Met2s残基，但不含Cys残基21。Y70,物合成活性。β苦瓜素还通过降低胚泡的附着,抑制YIPFS,R0T几个残基可能有RNA N-糖苷酶活性,它滋养层生长和破坏内部细胞的发育实现其堕胎活性。们在蛋白空间结构的一条沟中,形成-一个与逆转录病a和β苦瓜素不影响卵泡的补充和成熟。雄性动物实毒整合酶类似的结构，与整合酶竞争,从而抑制病毒验表明a苦瓜素和β苦瓜素不影响离体的大鼠睾丸间基因组的整合。D4 和E8是主要与Mn2*作用的残基，细胞在黄体激素诱导下的睾酮生成,也不影响离体的Mn2*等二价金属离子在MAP30抑制整合酶、松弛超大鼠无荚膜肾上腺细胞在促肾上腺皮质素诱导下的皮螺旋DNA有重要作用"。2.2. MAP30 的抗肿瘤活性质酮生成|川。MAP30对人恶性胶质瘤、表皮样瘤、黑色素瘤、2. MAP30骨髓瘤、肝癌、乳腺癌、成神经癌和前列腺癌表现出不同的敏感性。Fan等4的研究了重组MAP30对人类大MAP30( Momordica anti-HIV protein of 30 kD)是从肠癌LoVo细胞的影响,结果表明, Map30对LoVo细胞苦瓜中分离到的分子量为30kD的I型核糖体失活蛋的抑制成显著的时间和剂量依赖效应，可以观察到明白。核糖体失活蛋iboeinacivatinrotein,RIP)是显的温亡后应加核 沈缩和边男警集或分裂、猬亡小广泛存在于植物界的-类蛋白毒素,能够破坏核糖体体等中国煤化工因组降解。Northen结构，抑制蛋白质的生物合成。包含两种类型: 1和w{MYHC N M H Ge- -的Bax转录和表作者介绍:四川大学生命科学学院本科生。没有经费资助。通信地址:四川省成都市四川大学望江校区生命科学学院06生技，邮编: 610064。E-mail: liuxin01@gmail.com。3.综述生命科学仪器2009 第7卷/10月刊达上调，抗凋亡成员Bcl-2 则下调。Sun等5)在2001卷曲的pUC18质粒作为异源目标DNA，切除了3’末年用微阵列分析了MAP30处理的Kaposi肉瘤(多发于端GT二核苷酸的U3和U5作为底物。整合酶对目标DNA恶性AIDS病人)相关病毒(KSAV或HHV-8)感染的细胞进行随机剪切,并将病毒DNA的3'末端与目标DNA切的基因表达变化。他们报道发现MAP30影响了HHV-8口处的5’末端连接,形成缺口。结果表明MAP30可以感染的BC--2细胞中与扩张和增殖相关的病毒和细胞干扰病毒DNA 3'末端的定位,抑制HIV-1整合酶链转基因的表达,从而抑制恶性肿瘤生长。移活性，其抑制作用同样呈现剂量依赖性。2.3. MAP30 抗HIV活性HIV整合的最后-步是去整合,即病毒DNA脱离Lee-Huang 等2检测了MAP30的抗HIV活性。结宿主以便进-一步传播。Lee -Huang等I设计了38个核果表明抑制合胞体形成、p24产生和逆转录的半抑制苷酸的底物模拟逆转录病毒的重组中间体,其中发卡浓度分别为0.83nM、0.22nM和0.33nM,在这些浓度形的部分为病毒特异性的U5序列,哑铃形部分为任意下没有细胞毒性,并且短时间孵育对于病毒初期感染的目标序列，整合酶催化这两部分的分离。结果表明是有效的(15秒，25%抑制率);如果病毒吸附后MAP30可以抑制病毒部分从整体上裂解或释放。再要提高抗HIV活性则需要更高浓度(167- 1670nM)。2.4.与其它药物相互作用MAP30在33.4nM的浓度下没有观察到有抑制DNA合Bourinbaiar等$通过检测被HIV感染的MT-4细胞成和蛋白质生产，对p24产生和逆转录的抑制率分别中p24表达的降低来测量Map30对抗HIV药物地塞米为98%和87%;相比之下，天花粉蛋白(GLQ233)对松(DEX)、吲哚美辛(IND)、齐多夫足(AZT)的增强作HIV逆转录活性抑制90%的剂量却造成35%的DNA合用。结果显示，加入1.5nM的MAP30后，地塞米成抑制和40%的蛋白质合成抑制，显然MAP30的治松和吲哚的IC50降低了1000 倍并且没有产生细胞毒疗效果好于天花粉蛋白。MAP30还可以用于预防HIV性(对AZT没有明显影响),表明使用MAP30结合的性传播，因为即时是HIV和HSV抑制浓度1000倍低药理剂量的地塞米松和吲哚美辛可提高抗艾滋病毒的MAP30也不会影响精子的活力和运动心。治疗的疗效。2.3.1. RNA糖苷酶活性2.5. MAP30 对其它病毒的作用MAP30作为I型核糖体失活蛋白，在体外具有2.5.1. MAP30 抗HSV活性RNA N-糖苷酶活性。它不但作用于SS、5.8S和Bourinbaiar 等9|检验了MAP30对人合胞体病毒18SrRNA,而且仅仅作用于28SrRNA中的A4324或HSV的抑制。MAP30在334nM的浓度对胚肺成纤维细G4323核苷酸，解开A4324或C4323位置核糖和嘌呤胞系W1-38没有细胞活性影响，这与阿昔洛韦(ACV,之间的连接，使核糖体因不能结合延伸因子II而终止一种HSV特异的核苷酸类似物)相似,但它对HSV的抑蛋白质的翻译。制效果高出ACV很多,说明其抑制原理不同于核苷酸2.3.2. DNA拓扑失活活性抑制剂。无论是ACV敏感株HSV-1还是抗性株HSV-2,Lee- Huang等分别用天然和重组MAP30与人DNAMAP30的半抑制浓度都在0.1-0.3 μM:这比抗HIV的拓扑酶I (TopolI)处理HIV-1 LTR,超卷曲DNA都解浓度高了近1000倍。螺旋成开环和线性的状态。再用DNA回旋酶处理,2.5.2. MAP30 抗HBV活性TopoII处理过的DNA可恢复超卷曲状态，天然和重Fan等0利用人肝癌细胞检测MAP30对人乙肝病组MAP30处理过的DNA均不能恢复，说明MAP30能毒(HBV)的抑制作用，结果表明，MAP30 抑制HepG2.使超卷曲的病毒和质粒DNA不可逆地解螺旋,并催2.15细胞中的乙型肝炎病毒DNA的复制和HbsAg、HbeAg化双链断裂形成拓扑学上的无活性产物。的分泌,不同浓度的MAP30在较长时间(9天)作用后效2.3.3.抑制HIV-1整合酶活性果差异显著,表明抑制效果成剂量依赖性和时间依赖HIV整合开始时，整合酶结合到HIV LTR的末端性。MAP30 对胞外DNA的抑制好于核内eccDNA和序列,并从底物的标记链3'末端特异性地切去二核苷reDNA的抑制，对ssDNA、HBV mRNA和pgRNA几乎酸GT。Lee-Huang 等用- -段含21个碱基对的寡核苷无抑制作用。Fan由此推测核内有MAP30不能作用的酸作为底物，模拟HIV-ILTR的U3或U5末端，发现cccl中国煤化工MAP30可以抑制HIV-I整合酶对底物的切除，其抑制2.6.:[HCNMHG作用程度依赖于HIV-1整合酶和MAP30的浓度。Lee-nuang本中组人物竹困中成功表达MAP30。HIV 整合的第二步是链转移。Lee-Huang等T"以超结果表明天然和重组的MAP30对合胞体、p24生成和逆，4生命科学仪器2009 第7卷/10月刊转录的半抑制浓度几乎相同，在0.2nM- -0.3nM之间。可以利用定点突变技术将赖氨酸突变为其它不含氨基2002年Arazi等川"报道了用胡瓜黄花叶病毒-AGII作为侧链的氨基酸，再与PEG相耦连。但是MAP30有15载体在葫芦科植物(黄瓜、甜瓜、南瓜等表达MAP30,个赖氨酸，占6%，如果全部突变可能导致MAP30失这提供了一个可食用抗病毒蛋白的来源。遗憾的是活。另一种定点突变是通过计算机辅助预测抗原的定点Arazi没有提供蛋白产量的信息，也不知道果实里有没突变技术,可以选择性突变赖氨酸,有待于在MAP30中有表达。叶子中提取的MAP30蛋白对HIV-1合胞体和进一步研究。p24生成的半抑制浓度介于0.24至0.3InM,在3.3 μM3.1.2.巯基修饰时仍没有抑制细胞DNA和蛋白质的现象,对感染人类MAP30无半胱氨酸，但重组生产的蛋白可以在疱疹病毒8型(HHV- 8)的BC -2细胞系的半抑制浓度为不同位点定点突变出半胱氨酸,比较不同位点修饰后0.4nM:这些都说明南瓜表达的MAP30与天然分离的的清除率,从中选择清除率最低的位点。这种方法也抗病毒效果、细胞毒性情况是相同的。可以用于重组的MAP30。2.7. MAP30 片段化3.1.3.其它Huangl2根据MAP30天然的紧凑结构推测其中间如果蛋白结合较大分子量的PEG,血液中半衰期部分较重要，因此将其保护起来进行水解，得到三个会上升,但是活性会降低，-般结合1到2个EG链就主要片段,两个大的(21-22kDa,25- -26kDa)具有抗HIV足够发挥作用,因为少数长的PEG链比多数短的PEG链活性，半抑制浓度在0.2-0.4nM之间。中间片段与原更有效6。用PEG双酯、PEG- 甲基马来酸酐、PEG-蛋白相似，可以抑制p24表达,抑制HIV-1整合酶，具苯基羟基琥珀胺碳酸盐等可逆修饰蛋白，随着时间的推有DNA拓扑解旋活性,但没有细胞毒性,不抑制细胞移,聚乙二醇被酶解而减少,逐步释放蛋白,可减少PEG自由转录这说明MAP30蛋白水解片段仍具有生物活修饰带来的活性减少。除了线性的PEG分子外,基于赖性。有趣的是MAP30N末端的10个氨基酸和C末端氨酸或其它核心构建的分支PEG对蛋白质和多肽的修饰的76个氨基酸不是抗HIV活性所必须的1。C末端也有作用，由于一个修饰位点结合2个PEG,减少了是蛋白正确折叠和在核糖体上定位所必须的,因此可修饰位点数，从而降低了失活的可能，同时更好的保以调节RIP的活性而不影响其抗病毒功能对不同RIP护蛋白免收免疫系统的威胁(图1 )I71。分析表明N末端氨基酸序列可能决定RIP对HIV的治3.2. MAP30-PEG 结合物研究进展疗指数,例如天花粉蛋白与MAP30的N端44个氨基酸有相似性。3.聚乙二醇修饰0-0()兴口3.1. PEG修饰方法圈1分支型PEG修饰减少免疫原性对于注射用治疗性蛋白，增加分子量或负电性4.展望可以减少被肾脏滤过的可能，因此聚乙二醇(PEG)修饰能赋予蛋白质和多肽类多种优良性能,具体表现为循MAP30的PEG修饰还有很多未解决的问题,例如环半衰期延长(逃过肾过滤，很大程度上与修饰后分PEG修饰可能给蛋白的分离纯化带来挑战。目前的修饰子量有关)、免疫原性降低或消失、毒副作用减少、理主要集中在传统的氨基直链随机修饰,定点修饰、羧基化稳定性增强等,在很大程度上拓宽了蛋白质和多肽修饰、分支修饰、可逆修饰的效果还不清楚。在PEG分类的应用范围41。子量的选择。上可以有其它尝试。修饰后与其它药物的相3.1.1. 氨基修饰互作用情况也未见报道。大多数抗肿瘤实验均为体外实在PEG修饰早期,修饰靶点多为蛋白质或多肽的验,体内实验的效果未必同样理想;修饰后抗HIV的效氨基,包括赖氨酸的ε氨基和钛链末端的a氨基,多果还没有体外实验报道，更不用说体内实验了。为随机修饰，多个氨基的存在常导致反应产物的不均针对大肠杆菌或其它植物重组生产的MAP30的修一，也不利于分析和确定产物中聚乙二醇的修饰位点。饰也没中国煤化工效果与天然一样,由于远离活性中心的N端定点修饰可以有效地保持药况8重YHCNMH G的生产方式。Philip物的原有生物活性，所以可以用聚乙二醇的醛基衍生Lin Huang等将MAP30酶解，结果表明一些21kDa甚物(mPEG一CHO)选择性修饰蛋白质的末端氨基;也至0.8kDa的片段仍具有活性啊，这些片段可能仍具抗5综述.生命科学仪器2009 第7卷/10月刊原性或半抗原性，可以用PEG修饰，但这方面的工physicaJ Research Comnunieations, 1995. 208(2): p.79-785.作尚没有报道，今后可以进- -步探究这些片段与其庀[9] Burinbaiar, A.S. and s. LeHuang The acivity of plamt derived药物的相互作用情况。antirtrovinl proleins MAP30 and GAP3I against herpes simplex vinus ifction in vitro. 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Thefuture PEG modification research of MAP30 sugstiese are gven acording to the xisting methods of PEC molication.Keywords: RIP momorcharin,MAP30.HIV ,PEG