基因工程菌在木质纤维素生产燃料乙醇中的应用

专论与综述中国酿造2009年第2期总第203期基因工程菌在木质纤维素生产燃料乙醇中的应用王敏(河北衡水学院生命科学系,河北衡水053000要:利用基因工程技术对大肠杆菌( Escherichia coi、运动发酵假单胞菌(2 Zymomonas mobilis、啤酒酵母菌( Saccharomyces cere-进行改造,构建出一系列能够发酵木质纤维素水解产物(木糖、葡萄糖)的基因重组菌株,以提高发酵木糖和葡萄糖转化乙醇的能力,成为目前研究和开发的重点。文中对其研究进展及相关菌株载体的构建方法进行了综述关键词:基因工程;木质纤维素;木糖;葡萄糖;基因重组;乙醇中图分类号:TS26文献标识码:A文章编号:02545071(2009)020011-03Application of genetically engineered microbial strains in fuel ethanol production from lignocelluloseWANG Min(Department of Life Science, Hengshui University, Hengshui 053000, China)Abstract: Using Escherichia coli, Zymomonas mobilis, or Saccharomyces cerevisiae as original strain, a series of gene recombination strains whichcan ferment lignocellulose hydrolysis(xylose and glucose) were constructed by genetic engineering technology. How to improve the fermentation ca-pability of recombinant strains to produce ethanol from xylose and glucose is the focus of current research. Here, the research progress and the con-struction of related strains or vectors were reviewedKey words: genetic engineering; lignocellulose; xylose; glucose; gene recombination; ethanol木质纤维是地球上数量最大的一种可再生资源。据多种产物。人们通过代谢工程的手段构建重组菌,使之能估算,如果发展能源林业与回收利用废弃木质纤维并举,够发酵葡萄糖、木糖或者阿拉伯糖产生酒精。将分子生物则每年可保障替代I3以上运输燃料的酒精产量。为此,发学手段用于开发能发酵六碳糖和五碳糖的产乙醇优良菌展经济有效而环境友好的木质纤维生物转化乙醇技术,株主要从2方面着手:一是对常规的产乙醇菌株(如:Sac已成为世界生物能源科技发展的研究热点。木质纤维主 charomyces cerevisiae、 Zymomonas mobilis)进行工程改造要由纤维素、半纤维素和木质素组成。纤维素和半纤维素拓宽其底物利用范围;二是对能天然利用多种底物的微经过糖化和发酵转化为乙醇而木质素的降解物不含可发生物(如 Escherichia coli, Klebsiella oxytoca、 Erwinia等)进酵糖,只能通过燃烧供热(发电)或化学转化为燃料添加剂行工程改造,赋予并提高其产乙醇能力(其他生物制品或工业原料)加以综合利用吗1.1木糖的代谢途径美国等国家已开始将生物能源研究和开发的战略重虽然半纤维素多聚体的降解比较容易,但其降解产物心转移到以木质纤维生产乙醇的方向。针对我国国情,发戊糖(主要是木糖)发酵产生乙醇则要比纤维素的降解产展以木质纤维生物转化乙醇为重点的生物能源技术,建立物葡萄糖的发酵困难得多。自然界存在着某些天然利用以能源林业为依托并综合利用大量农业废弃物(如秸秆、木糖的微生物,包括细菌、酵母菌和丝状真菌,真菌与细皮壳等)林业残余物(如锯木屑、刨花、木材和造纸工业菌的木糖代谢途径不尽相同废料等)、城乡垃圾和杂草等低成本木质纤维资源的原料利用木糖的酵母菌及丝状真菌的木糖代谢途径,首先保障模式,可以避免以粮食为原料所带来的“与农争地和是在依赖 NADPH的木糖还原酶作用下还原木糖为木糖“与人争粮”的弊端,兼得经济、生态、环保、社会多重效益,醇随后在依赖NAD的木糖醇脱氢酶作用下氧化形成木是全面协调可持续发展的必然要求。酮糖,再经木酮糖激酶磷酸化形成磷酸木酮糖由此进入1代谢途径磷酸戊糖途径。PPP途径的中间产物磷酸葡萄糖及磷酸利用木质纤维素原料生产酒精实现商业化的主要技甘油醛通过酵解途径形成丙酮酸,丙酮酸或是经丙酮酸术难题在于开发合适的菌种。淀粉质原料水解液中主要是脱羧酶、乙醇脱氢酶脱羧还原为乙醇:或是在好氧的条件葡萄糖,而木质纤维素水解液中除含有葡萄糖等六碳糖外,下通过TCA循环及呼吸链彻底氧化成CO2。酿酒酵母菌还含有木糖、阿拉伯糖等五碳糖。传统的酒精工业所采用因缺乏木糖转化为木酮糖的酶,而不能利用木糖,但可以的菌种酵母和运动发酵单胞菌都不能发酵木糖或阿拉伯利用中国煤化工在酸酒酵母菌中木酮糖糖.自然界的一些细菌虽能发酵五碳糖但是其发酵产生也是CNMH进入PP途径经酵解形收稿日期:200810-13作者简介:王敏(191),女,河北景县人,讲师,研究方向为食品发酵2009No.2·12· Serial No203China BrewingForum and Summary成乙醇的作用下磷酸化形成磷酸木酮糖进入PP途径,但与PP与真菌(酵母菌及丝状真菌)的木糖代谢途径不同细途径偶联的是ED途径,通过ED途径产生乙醇间菌的木糖代谢途径是通过木糖异构酶直接转化木糖形成12葡萄糖代谢途径木酮糖,该酶不需要辅酶的参与,随后同样在木酮糖激酶葡萄糖主要通过EMP途径生成乙醇。a:糖代谢途径b:2-酮-3-脱氧6磷酸葡萄糖途径腺苷三磷酸木糖异构醇腺苷二磷酸葡萄糖6-磷酸木酮糖葡萄糖酸内酯6磷酸木酮糖激酶腺苷三磷酸6磷酸葡萄糖酸腺苷二磷酸5-磷酸木酮糖一5-磷酸核酮糖←-5-磷酸核糖2酮3-脱氧6磷酸葡萄糖酸转酮醇酶甘油醛3磷酸1,3-磷酸甘油酸景天庚酮糖甘油醛3磷酸苷三磷酸转醛醇3磷酸6磷酸果糖2磷酸甘4磷酸赤藓糖磷酸-果糖磷酸烯醇式丙酮酸2内酮酸甘油醛3-磷酸转酮醇酶乙醛+CO2附图乙醇代谢选径Attached figure. Ethanol metabolism pathway2基因工程菌脱氢酶,几乎没有酒精产生。陆坚等通过基因工程手段木质纤维生物转化乙醇是个动态发展、不断完善的技成功将 Zmobilis乙醇脱氢酶基因adhB克隆病导入大肠杆术。技术进步的核心方向或最终目的是要降低生产成本,菌中表达。同时也成功的克隆并表达了丙酮酸脱羧酶pd提高生物乙醇的市场(价格)竟争力。基本策略是生物的基因。外源基因在 Mobil中的克隆和表达系统正逐步完(如工程菌和纤维素酶)和工艺的(如预处理综合利用和系善。目前,已构建了许多载体,但是这些载体在 Z mobilis应统集成)优化并举,特别是生物的改进尚有较大的空间用通常不稳定,如何提高外源基因的表达与活性水平是构21大肠杆菌建高性能 amabilis工程菌的关键大肠杆菌( Escherichia coli的野生菌株能够利用非常美国佛罗里达大学的 JINGRAM LO等于20世纪80年广泛的碳源,其中包括六碳糖(葡萄糖、果糖、甘露糖)和五代就尝试了以外源基因补充(或改进)受体微生物的发酵碳糖(木糖、阿拉伯糖)以及糖酸等物质,即大肠杆菌可以代谢途径。他们将 Amabilis的C6发酵基因转入具备C5发利用木质纤维素降解产生的各种糖类。但是野生型大肠酵途径的 Escherichia coli除了成功使大肠杆菌获得在富氧杆菌缺少强有力的产醇发酵酶系统;厌氧发酵时糖代谢的和缺氧条件下发酵丙酮酸的功能外,这个由 lactose启动子主要产物是各种有机酸,乙醇含量很低。故大肠杆菌菌种加pd和adh基因串联组合的操作元还使丙酮酸的代谢具改造的重点是增强其产醇能力。为了实现这一目标,一般有向中国煤化工并使微生物生长明显优是用基因工程手段将运动发酵单胞菌的2个基因,pdc(丙于对CNMHGcellulolyticum中也得到酮酸脱羧酶基因)及adh(乙醇脱氢酶基因),克隆到大肠杆较好的表达。相对酵母菌发酵(以小时计)来说细菌发菌中,促使丙酮酸定向地转化成乙醇。酵有速度快(以分钟计)的优势。大肠杆菌能利用几乎所有的戊糖和己糖但缺乏乙醇22运动发酵假单胞菌专论与综述中国酿造2009年第2期总第203期·13·运动发酵假单胞菌( Zymomonas mobilis)代谢途径简菌较初始菌株木糖消耗和乙醇产率分别有很大提高单,通过ED途径专一代谢葡萄糖、果糖、蔗糖作为碳源和GOVINDASWAMY S等吗利用木糖发酵重组菌 SI cere能源。利用葡萄糖和果糖时,能够得到近似理论产量的乙 viSIte424A,研究了不同培养基上发酵木糖和葡萄糖的生醇。用酒精酵母菌发酵时葡萄糖经EMP途径生成乙醇。Z长动力学和乙醇产量。结果发现菌体在只含木糖的培养基mobilis酒精发酵的缺点是碳源利用面窄,仅限于葡萄糖、上的生长速度要慢于含葡萄糖或木糖-葡萄糖混合物的培果糖和蔗糖,而且代谢产物中副产物较多(如乳酸、乙醛、养基。在木糖葡萄糖混合培养基中,葡萄糖被优先利用醋酸硫化氢等)。另外缺少对木质纤维素水解液中存在的当向木糖培养基中添加葡萄糖时,木糖的利用率会降低,五碳糖(主要为木糖)的代谢能力。因此,运动发酵单胞菌说明葡萄糖对木糖的利用产生了阻碍的基因工程改造的主要目的就是拓宽其代谢的碳源类近年来,生物技术在木质纤维素转化乙醇中的应用研型,使其能代谢五碳糖。究,加速其技术工业化的进程,已成为该项技术研究者关Z mobilis的遗传改造主要是将产乙醇的关键酶(丙酮注的一个热点。而我国的植物纤维资源丰富,农业、森林酸脱羧酶和乙醇脱氢酶)移入其他可以利用淀粉质原料的食品发酵、轻化工业等都存在有大量可利用的纤维素资菌种中或者将其他微生物中相关的淀粉质原料水解酶基因源叫,早日将其应用于工业化生产乙醇的过程,是我国能转移到 Amabilis中,从而获得乙醇产率高的 Amabilis菌株明。源可持续发展的重要途径。美国国家再生能源实验室的 ZHANG M等叫在1995年使用穿梭质粒pZB5,将取自大肠杆菌的4个基因:木糖异参考文献:[陈介南,王义强何钢等木质纤维生产燃料乙醇的生物转化技术构酶基因(xyA),木酮糖激酶基因(xyB),转醛醇酶基因门林业科学,2007,43(5):99-105(aB)和转酮醇酶基因(AD引入运动发酵单胞菌细胞中。(2] SEUNGDO K, BRUCE E D. Global potential bioethanol production通过木糖异构酶和木酮糖激酶的作用,可以有效地将木糖from wasted crops and crop residues []. Biomass Bioencrg, 2004, 26:转化成5-磷酸木酮糖,而在转醛醇酶和转酮醇酶的作用下,361-375.5-磷酸木酮糖进一步转化成葡萄糖6-磷酸和甘油醛3-磷因]孙金风,诸葛健,王正样重组肠道细菌作为产乙醇生物催化剂的研酸。这2种物质进入ED代谢途径后,在运动发酵单胞菌自究进展[工业微生物2004,34():44[4]鲍晓明高东,王祖农木糖代谢工程菌的研究进展D]生物工程学身的酶作用下生成乙醇报,1998,14(4):355358.23酵母菌]陆坚,韦宇拓,黄等利用葡萄糖、木糖生产燃料酒精的基因木质纤维含有半纤维素其糖化不仅产生C6糖①gh工程菌构建广西农业生物科学2005,24(3):1817-190.cose及其异构体),而且有C糖(D- xylose和 L-arabinose)。阿 6INGRAM L O, CONWAY T. genetic engineering of ethanol production由于普通酵母菌只能发酵C6糖,对C5糖缺乏代谢能力,而in Escherichia coli []. Appl Environ Microb, 1987, 53(10) 2420-2425.且易受降解产物的抑制,半纤维素的利用在相当长的时期被⑦ ALTERTHUM F, INGRAMLO. Eficient ethanol production from g忽视,直接影响了木质纤维原料生物转化乙醇的经济效益。ron microb,198955(8):1943-1948.自然环境下然微生物不能够将木质纤维糖化液中的C糖高卫华,张敏华刘成等能利用五碳糖和六碳糖生产乙醇的基因和C5糖同时快速有效地转化为乙醇,因此开发对C6糖和工程菌菌株的构建D工业微生物,2004,34(1):5662C糖进行快速、完全、同步发酵并且抗逆性强的工程菌株刘艳赵海戚天胜运动发酵单胞菌发酵生产乙醇研究进展U成为当务之急。酸酒科技,2006(3):9294郭亭等叫以AS2190作为出发菌株,在其中建立木[10] ZHANG M, EDDY C, DEANDA K, et al. Metabolic engineering of a糖代谢途径,并对工程菌株GZ4-127进行初步酒精发酵研pentose metabolism pathway in ethanologenic Zymomoas mobilisE]Science,1995,267(5195):240243究。但对木糖的利用过程中,乙醇的产率很低,远远不能满(1]郭亭梁达奉鲍晓明、工业酸酒酵母木糖代谢途径的建立及酒精足要求。发酵初步研究门甘蔗糖业,2007(3):2629沈煜等四根据代谢工程原理,利用整合载体 D YMIKP,[2沈熳,王颗,史文龙等酿酒酵母工业菌株中Ⅺ木糖代谢途径将来自 TI thermophilus的木糖异构酶XD基因(xylA)和的建立门中国生物工程杂志,2005,25():69-73.SI cerevisiae自身的木酮糖激酶XK)基因(xksl)插入酿[3] GOVINDASWAMY S, VANE L M. Kinetics of growth and ethanol酒酵母工业菌株NAN227的染色体中,在酿酒酵母工业菌中国煤化工using genetically engineeredhnol,2007,98(3):677685.株中建立了Ⅺ1路径的木糖代谢途径,得到工程菌株[4CNMHG精的研究进展门中国酿NAN2114。木糖、葡萄糖共发酵摇瓶实验结果表明,工程2006(8):11-15