乙醇对角质酶性质的影响

研究论文乙醇对角质酶性质的影响王莉,王森1.2(1.江南大学食品学院江苏无锡214122:2.食品科学与技术国家重点实验室江南大学,江苏无锡214122摘要:研究了乙醇溶液对角质酶性质的影响同时用圆二色光谱和荧光光谱法对经过硫酸铵沉淀、镍柱亲和层析等方法获得的电泳纯角质酶进行了构象研究。结果表明,在体积分数40%、30%和20%乙醇溶液中角质酶催化反应的最适温度分别为50、55和65℃;在37℃下,酶在体积分数20%~50%乙醇中具有较好的稳定性,体积分数30%和40%乙醇对角质酶具有激活作用;角质酶在体积分数30%和50%乙醇中催化反应的最适pH分别为9.5和9.0;在体积分数30%乙醇溶液中角质酶的pH稳定范围为6.~10.5.角质酶在50℃的乙醇溶液中的失活动力学研究表明,角质酶的失活属于一级动力学反应(R2>0.98)。从角质酶构象的研究结果可以看出,在乙醇体系中角质酶的二级结构和三级结构都发生了相应的变化。关键词:角质酶;乙醇;酶学性质;构象中图分类号:Q814.9文献标识码:A文章编号:1673-1689(2012)01-033-07 Effect of Ethanol on the Property of Cutinase WANG Li, WANG Miao*1.2 (1. The School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China: 2. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122. China) Abstract: In this manuscript, effect of ethanol solutions on the biochemical property and con- formation of cutinase were studied. The results showed that the optimum temperatures of cuti- nase were 65 C, 55 C and 50 C respectively in 20%(V/V), 30% and 40% ethanol solutions. In 20% and 50% ethanol solutions cutinase was stable at 37C. In 30% and 50% ethanol solu- tions the optimum pH of cutinase were 9. 5 and 9.0 respectively. In 30% ethanol solution the pH stability range of cutinase was 6. 5-10. 5. In 30% and 40% ethanol solutions activity of cutinase at 37 C was enhanced. The inactivation kinetic of cutinase was researched in ethanol solutions at 50. The results showed that the inactivation kinetic of cutinase in ethanol solu- tions followed the first order reaction(>0.98). And the secondary and the tertiary structure conformations greatly changed in ethanol solutiods. Key words: cutinase, ethanol, enzymatic property, conformation生物酶作为高效的生物催化剂,传统意义上是的催化反应已经倍受关注,酶学领域也有了一个全在水溶液中进行的,但是,目前对其在有机溶液中新的分支一非水酶学2。通常认为在极性溶剂中收日期:2092基金项目:国家自然科学基金项目(20776063);家计划863项目(2011AA100905)通信作者:王森(1962-),女江苏无锡人工学博士,教授,博士研究生导师,主要从事食品生物化学方面的研究。 mail: mwangjiangnan. edu.cn WANG Li. et al: Effect of Ethanol on the Property of Cutinase Research Article酶的稳定性较差,大部分非水相酶反应均被限制于1.3试验方法相对非极性的溶剂中。一方面非极性溶剂利于提1.3.1pNPB水解酶活力的测定分光光度法。高酶的稳定性,另一方面,在非极性溶剂中酶易于酶活在20℃下测定,反应体积为1mL,其含20μL保持其活性构象而表现出高的催化活力。极性有酶液、50mmol/L对硝基苯丁酸酯和50mmol/L硫机溶剂会争夺酶分子表面的结构水,使酶失活。因磺脱氧胆酸钠pH为8.0的缓冲液980μL。在405此,对酶在有机溶剂中性质及稳定性的研究主集nm记录对硝基酚的生产速率。酶活定义:20℃下,中与非极性溶剂中3每分钟催化对硝基苯丁酸酯水解1μmol对硝基酚角质酶是一种可以降解角质并产生大量脂肪的酶量为一个酶活力单位酸单体的水解酶,是a/水解酶家族中相对分子质1.3.2酶的分离与纯化将发酵液于4℃、量较小的成员,其活性中心含有典型的催化三元组1000r/min离心20min去除菌体,上清液经质量(Ser His so、sp17),具有酯酶和脂肪酶的功分数50%的硫酸铵盐析,4℃10000r/min离心能。角质酶可降解不溶性甘油三酯、可溶性酯和20min,得沉淀并透析,经0.45nm的滤纸微滤,然角质等聚酯,也能破坏角质多聚物分子的酯键使其后经镍柱进行亲和层析得纯酶制品水解为单体和小分子寡聚体-。它作为一种多功1.3.3蛋白质含量测定福林酚法能水解酶,在食品、化工及纺织等诸多领域都具有1.3.4Sa-age分析分离胶质量浓度为12广泛的应用-g/dL,浓缩胶质量浓度为2.5g/dL,电泳采用pH目前,国内关于角质酶的研究较少,国外对角8.3的Tris-hCl缓冲体系,电泳后用考马斯亮蓝质酶的研究大多集中于酶学性质、结构以及生产菌G250染色。株构建、以及酶在反胶束体系中的性质及应13.5角质酶性质的研究角质酶性质研究采用用10-12,虽然有研究表明角质酶在体积分数75%硫酸铵分级沉淀、透析后的粗酶液。乙醇中20℃下放置18h活力基本不丧失13,但并1)角质酶在乙醇溶液中的最适反应温度以未对酶在乙醇体系中的性质进行系统研究。乙醇ppB为底物,用不同体积分数乙醇溶液(20%、在工业中被广泛应用,是一种良好的有机溶剂,许30%、40%、50%)配制pH8.0、20mmol/L的缓冲多食品原料中功能性成分的提取都是用乙醇作为液代替pNPB水解酶活测定方法中的缓冲液,在不溶剂的,研究角质酶在乙醇中的催化性质,将有助同温度下(37~70℃)测定酶的剩余活力,以天然酶于扩大角质酶的应用范围活力为100%,确定该酶在不同体积分数乙醇溶液中的最适反应温度。材料与方法2)角质酶在体积分数30%和50%乙醇溶液中1.1实验材料的最适反应pH值分别用体积分数30%和50%角质酶发酵液:作者所在实验室提供;对硝基的乙醇溶液配制不同pH值(6.0~11.0)的缓冲液,苯丁酸酯(pNPB)、硫磺脱氧胆酸:购自公代替NPB水解酶活测定方法中的缓冲液,在其最司;其它试剂均为分析纯试剂。适反应温度下测定酶的残余活力,以天然酶活力为1.2实验仪器100%,研究酶在体积分数30%和50%乙醇溶液中ARB120电子天平:尤尼柯上海仪器有限公司最适作用pH。所用的缓冲液体系是用体积分数产品AB204N电子天平:上海森信实验仪器有限30%和50%乙醇溶液配制,分别为:20mmol/L磷公司产品;L20型pH计梅特勒托利多仪器有限酸缓冲体系(ph6.0~7.0);20mmol/ Tris--HCl公司产品; Backman Coulter(USA)台式冷冻离心缓冲液体系(pH7.5~9.0);20mmol/L磷酸氢二机:上海力申科学仪器有限公司产品;V-1800型可钠NaOH缓冲体系(pH9.5~11.0)见分光光度计:上海美谱达仪器有限公司产品;F3)角质酶在乙醇溶液中的热稳定性为了研7000荧光光谱仪:日本日立公司产品;MOS450究该酶的在不同体积分数乙醇溶液(20%、30%、AF-cd圆二色光谱仪:法国Bio -logic-公司产品40%、50%)中的热稳定性,将酶液按一定比例分别与不同体积分数乙醇溶液配制的pH8.020mmol研究论文王莉,等:乙醇对角质酶性质的影响 Tris-H-HCl缓冲液混合在37、45、50和55℃保温,9.75%,以上各步的纯化结果如表1所示。每隔一定时间取出部分酶液,立即在冰浴中冷却,按pNPB水解酶活力测定方法测定残余酶活。4)角质酶在体积分数30%和50%乙醇溶液中的pH稳定性将酶在37℃、不同pH值(pH6.0~11.0)的缓冲液中放置12h,每隔一段时间取出部分酶液,按pNPB水解酶活力测定方法测定残留酶活。缓冲液体系同1.3.7。5)酶在乙醇溶液中的失活动力学将酶液按一定比例分别与体积分数20%、30%、40%、50%乙E醇溶液配制的pH8.0、20mmol/ Tris--HCl缓冲液混合,在50℃下放置一定时间,每 Lane隔一定时间取 Purified cutinase Lane Molecular weight marker出部分酶液,按pNPB水解酶活力测定方法测定残97400B.66200;C.43000:D31000余酶活。图1pNpB水解 SDS-PAGE酶的凝胶电泳根据 Arrhenius方程lnA=-kt和lnk=lnk一 Fig. I SDS-PAGE of cutinase(E/RT)计算失活动力学参数。其中A是酶活,U/ml;T是绝对温度,K;E是活化能;t12是半衰表1角质酶纯化过程参数期,min;t是保温时间,min;R是气体常数,8.314 Tab.I The parameters of cutinase purification510j/(k·mol);k是速率常数,1/min纯化总酶活/U回收总蛋白质/比酶活纯化过程率%mg(/mg)倍数1.3.6角质酶在醇溶液中的构象圆二色光谱检测:将纯化后的样品溶解于pH8.0、20mmol/L的粗酶液37384.40100.001965.9519.021.00Tris-HCl缓冲液中室温放置30min,立即冰浴;样盐析37111.9599.27975.4538.052.00品溶解于体积分数30%、50%乙醇溶液配制的pH透析36858.6498.59896.0641.132.168.0、20mmol/ Tris-HCI缓冲液中,各自分别在镍柱层析3646.689.7531.36116.286.1237℃、50℃下放置30min,立即冰浴。蛋白质质量浓度为0.1mg/mL测定远紫外区(190~250nm)2.2角质酶在乙醇溶液中的性质CD谱,扫描速度1nm/s,重复5次。圆二色谱用平2.21乙醇体积分数对角质酶最适反应温度的影均椭圆度[表示,单位为度·厘米2分摩尔(dg·温度是影响酶催化作用的主要因素之一,一方cmdmol)面随着温度的升高,化学反应速度加快,另一方面荧光光谱检测:样品处理方式同圆二色光谱检高温会使酶变性失活,有机溶剂的加入也会影响酶测。荧光扫描采用F-7000FL型分光光度计,激发反应的最适温度。因此,需要通过实验确定酶在有波长为280nm,发射波长为290~450nm1-20机介质中酶催化的最适温度,以提高酶催化反应速率。2结果与分析在不同体积分数乙醇溶液中,角质酶的最适反2.1角质酶的分离纯化应温度也不同,且不同于酶在正常情况下的最适作将含有角质酶的发酵液通过硫酸铵分级盐析、用温度60℃。由图2可知,体积分数20%、30%透析、镍柱亲和层析进行分离纯化,纯化表见表1,和40%乙醇溶液中,酶的最适反应温度分别为得到的样品通过 SDS-PAGE凝胶电泳检测只显现65℃、55℃和50℃,且当乙醇体积分数低于40%时,出一条谱带,说明纯化的角质酶已达到电泳纯(图角质酶的催化活力明显高于其在缓冲液中,该体系1)。纯化后pNPB水解酶比活力从19.02U/mg提对角质酶具有激活作用,在体积分数30%乙醇溶液高到116.28U/mg,纯化倍数为6.12,回收率为中的酶活力最高可达缓冲液中的2.14倍,当乙醇体积分数达到50%时,酶活力显著降低。有研究表明 WANG Li.et al: Effect of Ethanol on the Property of Cutinase Research Article上述现象可能是由于适当体积分数的乙醇改变了酶37℃45℃50℃55℃的构象,从而使酶分子更有利于与底物接触进行催化120反应,当乙醇浓度过高时,它对酶构象的改变超出了10080酶的承受能力,使酶变性,酶活力下降甚至失活2。避6020%30%40%50%4022020170204080100期炙时间/min120(b)买7037℃45℃12050℃55℃20401003540455055606570温度℃80图2不同体积分数乙醇中角质酶的最佳反应温度60 Fig.2 Optimal temperature of cutinase in ethanol solutions402.2.2角质酶在乙醇溶液中的热稳定性研究角20质酶在乙醇溶液中热稳定性研究表明(见图3)。在0008020406080100体积分数20%乙醇溶液中,45℃以下酶活基本保持时间/min不变,酶相对稳定。温度高于45℃时,随着温度的(c)升高,酶的稳定性显著降低(图3(a));在体积分数12037℃45℃50℃55℃30%乙醇溶液中,37℃时酶稳定性较好,在此条件100下保温100min后,残余酶活仍比在缓冲液中的原80始酶活高。但在45℃下酶的稳定性有所下降,且随着温度升高酶稳定性快速下降(图3(b));当乙醇买40体积分数为40%~50%时,酶只在37℃具有较好的20热稳定性(图3(c)、(d))。这说明酶在高体积分数20406080100的乙醇溶液中,只有在低温下具有较好的稳定性。时间/mi(d)角质酶在水溶液中40℃下保温70h,残留酶活仍在80%以上;在60℃时半衰期为42h,与此相图3角质酶在乙醇溶液中的热稳定性(a、b、cd分别为角质酶在体积分数20%、30%、40%和50%乙醇中的热比在乙醇溶液中热稳定性有所下降。乙醇是与水稳定性)互溶的极性溶剂,会与酶争夺水分子,甚至除蛋Fig.3 Thermostability of cutinase in ethanol solutions白质分子的“必需水”层,扰乱酶分子天然构象的形(20%),b(30%),c(40%)andd(50%)成3,在乙醇存在的条件下,高温更易使酶变性,从2.2.3角质酶在乙醇溶液中的最适pH值由上而使酶在醇中的稳定性降低。述研究结果可知角质酶在体积分数30%乙醇溶液中的催化活性最高,当乙醇体积分数大于30%时,1203050℃5角质酶的催化活性下降,达到体积分数50%时只在10037℃下有一定的稳定,选择研究体积分数30%和8050%乙醇中角质酶的最适反应pH值具有代表性。60前人研究表明,角质酶在水溶液中的最适pH408.01,乙醇对角质酶最适pH值的影响如图4所200示,角质酶在乙醇溶液中的最适反应pH值发生了020406080100时间/min改变,在体积分数30%、50%乙醇溶液中的最适反 (a)应pH值分别为9.5和9.0,在体积分数30%乙醇研究论文王莉等:乙醇对角质酶性质的影响溶液中pH8.0~10.0范围内酶活变化不大,但均-pH6.0-ph9.5pH11.0比在水溶液中有大幅提高,当pH为9.5时,最大活 150--pH 6.5-X-pH8.0-0-pH10.5pH7.0力是水中的2.45倍。很多研究表明酶在有机介质120中催化反应的最适pH值通常与酶在水溶液中反应90的最适pH值接近或相同7,这主要是针对非极60性有机溶剂而言,乙醇是与水互溶的极性溶剂,它30对角质酶的激活效应有待进一步探讨。体积分数30%乙醇681012250体积分数50%乙醇时间200图5角质酶在体积分数50%(a)、30%(b)乙醇中的pH稳150港安要定性100 Fig. 5 pH stability of cutinase in ethanol solutions (a)(50%)and(b)(30%)502.2.5角质酶在乙醇溶液中的失活动力学为了进一步探索分析不同体积分数乙醇对角质酶活力 pH的影响,作者对50℃下角质酶的失活动力学进行图角质酶在体积分数30%、50%乙醇中的最适反应H值研究,不同乙醇体积分数下角质酶的失活动力学曲 Fig.4 Optimal pH of cutinase in ethanol solutions线见图6所示。2.2.4角质酶在乙醇溶液中的pH稳定性由角体积分数20%乙醇质酶在乙醇溶液中最适反应温度和温度稳定性可体积分数40%乙醇知,37℃时角质酶在体积分数50%以下的乙醇溶体积分数30%液中都具有一定的稳定性,且角质酶在体积分数30%乙醇溶液中活性最高;从角质酶在乙醇溶液中6.5最适反应pH的研究结果可知,角质酶在体积分数50%乙醇溶液具有一定的酶活,且乙醇作为一种食5.5品级的有机溶剂,高体积分数的乙醇在工业中被广泛应用因此研究角质酶在体积分数50%乙醇中的5pH稳定性是有必要的。角质酶在乙醇中的pH稳定4.5性如图5所示,在体积分数50%乙醇溶液中角质酶的pH稳定性较差,短时间内,在pH6~7的范围内405101520时间/min有一定稳定性,当pH到9.0时,酶的稳定性迅速下图6角质酶在醇溶液中的失活动力学曲线降(图5(a)),而在30%乙醇溶液中角质酶较稳定,Fig.6 Inactivation curves of cutinase in ethanol solutionspH稳定范围为pH6.5~10.5(见图5(b))从图6可以看出,角质酶的失活反应基本符合150→pH6.0一级反应动力学的规律,利用 Arrhenius方程可以6120pH7.0计算出各种失活动力学参数,结果如表2所示。pH8.0从表2可以看出,随着醇体积分数的增大,酶90pH9.0的失活速率常数增加,失活的活化能下降。角质酶60在体积分数20%乙醇溶液中半衰期为71.63min,00而在体积分数50%乙醇溶液中其半衰期迅速下降到5.23min。这说明50℃下角质酶会很快失活。024681012时间/h酶失活的活化能E,与角质酶的稳定性有关,E越(a)大角质酶越稳定,由此也可以看出随着醇体积分数 WANG Li.et al: Effect of Ethanol on the Property of Cutinase Research Article的增大,角质酶的稳定性在下降。条件下角质酶的荧光强度。蛋白质在340nm左右表2角质酶在醇溶液中的失活动力学参数的荧光强度主要与蛋白质分子中Trp和Tyr残基Tab.2 The inactivation kinetic parameters of cutinase in eth--的暴露和解离的程度有关2,213。荧光发射光谱的 anol solutions变化与生色基团的微环境等多方面因素相关。由乙醇失活速率活化能半衰期此推测,角质酶在37℃下30%乙醇中三级结构发体积分数/%常数kE()/(min)生了有利于催化活性的变化。200.009617636.0771.63表3角质酶分子构象中各结构单元含量300.053112997.2213.89 Tab. Secondary structural compositions of cutinase400.105611106.916.86处理方式a螺旋/%3折叠/%转角/%无规则500.118610712.085.23卷曲/%缓冲液、常温42.3715.2717.3925.082.2.6角质酶在醇溶液中的构象上述研究表明30%乙醇、37℃9.2445.8810.8433.94角质酶在37℃体积分数30%的乙醇溶液中具有较30%乙醇、50℃55.663.4019.4220.52高活性,且有较好的稳定性,为此,作者对角质酶的构象进行了研究。图7是角质酶在不同温度下、不50%乙醇、37℃9.1145.9510.9133.93同体积分数的乙醇溶液中放置30min后测得的圆50%乙醇、50℃9.3245.7910.7234.17二色图谱。2401030%37℃190缓冲液50%37℃37℃30%一缓冲液37℃50%50%50℃14030%50℃50℃30%230250米9050℃50%4020503800-10290320350380410440波长/nm波长/nm图7不同方式处理后角质酶的圆二色光谱图8不同方式处理后角质酶的荧光发射光谱图 Fig. 7 Circular dichroism spectrums of cutinase incubated Fig.8 Fluorescence intensity of cutinase incubated 30min in 30min in different ways different ways从图7可以看出,在不同体积分数的乙醇溶液3结语中角质酶CD光谱有较大差别,通过 SELCON3软件分析,得出角质酶在不同体系中a螺旋、折叠、1)角质酶在低体积分数的乙醇溶液中的催化转角及无规则卷曲的比例(见表3)从表3的数据性质发生了变化。20%、30%、40%乙醇溶液中的可以看出,酶的相对活力与其二级结构之间没有明最适温度分别为65、55、50℃。热稳定性研究表显的相关性。因此作者采用荧光光谱法对酶蛋白明,在37℃下,酶在体积分数20%~50%乙醇中都的三级结构进行进一步的研究。图8是不同体系具有较好的稳定性中角质酶的荧光发射光谱,角质酶在336~342nm2)角质酶在体积分数30%和50%乙醇中催化处有一特征荧光发射峰,但在50℃下、体积分数反应的最适pH分别为9.5和9.0。在30%乙醇溶50%乙醇中角质酶的荧光发射峰位红移至34nm,液中角质酶的pH稳定范围为6.5~10.5;在50%其他条件下角质酶的荧光发射峰未发生位移,只是乙醇溶液中角质酶的pH稳定性较差。荧光强度不同,对于活力较高的37℃下30%乙醇3)角质酶在50℃的乙醇溶液中的失活动力学中的角质酶,在336nm的荧光强度明显低于其他研究表明角质酶的失活属于一级动力学反应(R2研究论文王莉等:乙醇对角质酶性质的影响>0.98)活性没有明显相关性,但与三级结构有很大的相关4)用CD光谱法和荧光光谱法对电纯的角质性,且角质酶在37℃下30%乙醇中三级结构可能酶进行构象研究表明,角质酶的二级结构与其催化发生了有利于催化活性的变化。参考文献(References):[1]陈晟,陈坚,吴敬一种嗜热细菌来源角质酶的分离纯化及酶学性质[]应用与环境生物学报2009,15(6):846-850 CHEN Sheng. 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