乙醇对肌肉卫星细胞myogenin表达的影响

东南大学学报(医学版)674J Southeast Univ( Med Sci Edi2012,Dec;31(6):674-680论著乙醇对肌肉卫星细胞 myogenIn表达的影响沈干1,吴京2, Gordon huggins(1.南京医科大学第二附院东院整复外科,江苏南京21003;2. New England Medical Center,Tufts University, Massachusetts Boston 02115)摘要]目的:探讨慢性酒精中毒过程中乙醇对肌肉卫星细胞 myogen表达的影响及其在酒精性肌肉损伤中的作用。方法:(1)体外实验:取 Sprag- Dowley大鼠,原代培养大鼠肌肉卫星细胞,设实验组(乙醇作用组)与对照组(正常培养液对照组),培养细胞至80%融合时,更换为分化培养液,对实验组与对照组卫星细胞形成的肌管计数,并观察卫星细胞 myogenin的表达。(2)动物实验:予小鼠乙醇饮食(Ⅰ个月)制造乙醇中毒动物模型,在损伤后肢肌肉后第27天取组织切片观察损伤部位肌肉卫星细胞增殖及新肌束形成情况。结果:实验组肌管计数及卫星细胞 myogenIn的表达均低于对照组(P<0.05),但乙醇饮食小鼠损伤肌肉标本中卫星细胞及新肌束数量与正常饮食小鼠差异无统计学意义(P>0.05)。结论:乙醇可以通过降低肌肉卫星细胞的 myogenin表达抑制其肌性分化,减少卫星细胞形成肌管的数量。关键词]肌肉;卫星细胞;乙醇; myogenIn;分化中图分类号]R685.2文献标识码]A[文章编号]1671-6264(2012)06-0674-07doi:10.3969/j.issn.1671-6264.2012.06.003Effect of ethanol to myogenin expression in muscular satellite cellsSHEN Gan, WU Jing, gordon Huggin(1. Department of Plastic and Reconstructive Surgery, the Second Affiliated Hospital of Nanjing MedicalUniversity, Nanjing 210003, China; 2. New England Medical Center, Tufts University, BostonAbstract]Objective: To investigate the effect of ethanol to myogenin expression in muscular satellite cells and it'srole in alcoholic muscle atrophy. Methods: 1 )In vitro study, Sprage-Dowley rats were used, satellite cells wereharvested and cultured from rat muscle, experimental group( ethanol culture medium )and control group( normalculture medium )were set. When cells became 80% confluent, growth culture medium was changed into differentiationmedium. To evaluate the effect of ethanol, myotube quantitation and Western Blot for myogenin expression wereperformed. 2 )In animal study, animal model of alcoholism was made by alcoholic diet( 1 month ) then muscle ofposterior limb was harmed, the proliferation of satellite cells and formation of new muscle bundles were evaluated byhistological section. Results: The number of myotubes and expression of myogenin in experimental group were lessthan control group; but there was no significant difference on numbers of satellite cells and new muscle bundlesbetween two groups in animal model of alcoholism. Conclusion: Ethanol can inhibite differentiation of satelliteuscdecreasing of myogenin expressionI Key words muscle; satellite cells; ethanol; myogenin; differentiean中国煤化工CNMHG肌肉卫星细胞位于骨骼肌纤维的肌细胞膜与基底膜之间史新的朊力,又被称为肌肉干细胞收稿日期]2012-06-01修回日期]2012-06-15[基金项目]国家自然科学基金面上项目(81071480)作者简方据1968-,男,江苏南京人,主任医师,医学博土。Eml: anshen@ yahoo, cn沈干,等.乙醇对肌肉卫星细胞 myogenin表达的影响675在肌肉形成以及肌肉损伤修复中扮演重要作用。慢性中贴壁培养,每2日换液Ⅰ次,待细胞接近80%融合酒精中毒可引起肌肉萎缩,甚至引起酒精性心脏病。时进行实验本硏究中作者对慢性酒精中毒过程中乙醇是否通过损1.2.3卫星细胞向肌肉诱导分化将卫星细胞培养害卫星细胞而引起酒精性肌肉萎缩、降低卫星细胞修液置换为诱导分化液(DMEM+2%马血清),实验组分复损伤肌肉的能力作一探讨。化培养液中另加0.01%~1%的乙醇,分化培养1周。1资料和方法观察两组卫星细胞形成肌管( myotube)的数量。由非本实验参与人员随机选择不同培养时间培养皿中至少1.1实验动物及分组3个光镜下视野(×10),计算肌管的数量,并进行统计日龄2~3 d sprag- Dowley(SD)大鼠及FVB成年学处理。小鼠来自查尔斯河实验室(美国,波土顿)。(1)体外1.2.4卫星细胞形成肌管的检测鉴定细胞及肌管实验分组:获取大鼠肌肉卫星细胞后实验分实验组以多聚甲醛在-20℃下固定1min,然后由PBS漂洗2乙醇作用组)及对照组(正常培养液对照组)。卫星次;以10%马血清封阻1h,然后加入一抗 myogenIn及细胞生长培养2d后更换为诱导分化液(DMEM+2%肌肉重链蛋白MHC(1:200小鼠单克隆抗体, Sigma公马血清)诱导分化1周。实验组生长培养液及分化液司产品)作用半小时后,以PBS漂洗2次,加入二抗中加入1%的乙醇,共作用9d。对照组卫星细胞培养(抗小鼠二抗连接免疫荧光Cy3, Sigma公司产品),作不加乙醇。(2)动物实验分组:FVB成年雄性小鼠,用半小时后,以PBS漂洗2次。细胞核以DAPI染色。体重20~30g,随机分为两组,每组10只。实验组给最后荧光显微镜观察并拍照予乙醇饮食1个月;对照组给予正常饮食。然后检测1.2.5 Western blot检测乙醇对卫星细胞 myogenIn表肌肉损伤后再生情况。达的影响于加入诱导液之前(0d)及诱导后的第1、1.2试剂及方法3、5、7d采取标本,按 PIERCE公司Ec- Western Blot试1.2.1试剂胰蛋白酶( Sigma),Ⅱ型胶原酶(美国,剂盒操作说明书作 Western blot蛋白检测。卫星细胞wort- hington),F10培养液、胎牛血清(FBS)、DMEM及肌管裂解,蛋白电泳,转膜,滴加 myogenin((1:200)培养液、马血清均为 Gibco公司产品。ADS缓冲液由抗体,umi- Phos WB化学荧光素底物标记,暗房X光Gorden huggins实验室提供。80μm尼龙网( Becton,片曝光。内参照为 GAPDHDickinson and Company,美国),10m/2(C3H)细胞系由1.2.6乙醇对10Tl/2(C3H)细胞系的moD质粒影Gorden huggins实验室提供,myo质粒由 Gorden响小鼠胚胎间充质干细胞10m2(C3H)细胞系转Huggins实验室提供,鼠乙醇饲料( Dyets#710260,美染myoD质粒。6孔板培养10T1/2细胞细胞数量为国),鼠对照正常饲料 Dyets,#710027,美国)。4×103,待细胞80%融合后,按照 Polyfectamine使用1.2.2肌肉卫星细胞获取将SD大鼠断颈处死,以指南进行操作,转染myoD质粒。培养2d后,更换为75%酒精消毒皮肤,取后腿肌肉,冷PBS冲洗数次,以含马血清的分化培养液,作用2d后收取细胞, Western锐利眼科剪反复剪切肌肉组织,直至肌肉呈肉糜状。Blωt检测乙醇对1OT/2(C3H)细胞moD质粒的表达加入终浓度为100U·m-Ⅱ型胶原酶及0.4mg·及 myogenIn表达的影响。ml-胰酶消化酶溶液,置入37℃水浴箱中,每15-1.2.7动物实验予FVB小鼠乙醇饮食1个月,对20min振荡1次,消化30~45min,吸取消化液与细胞照组予正常饮食。然后制造鼠后肢肌肉损伤模型。具的混悬液,由80μm的尼龙滤网滤去肌腱等组织碎体操作如下:常规消毒,切开皮肤,分离后肢胫前肌,以片,对未消化的肌肉组织可加入0.05%胰酶,37℃水蚊式钳横行夹断肌肉,同时将BrU药片植入小鼠皮浴箱中再消化20min,不断摇晃直至大部分肌肉组织下,在损伤后的第2天和第7天取肌肉标本,固定后切被消化。同样以80μm的尼龙滤网滤去未消化的组片,Br染色。光学显微镜下观察肌束及BrU染色织碎片。阳性的卫星细胞,计数并拍照。细胞混悬液离心5min(1200r·min-1),弃去上1.3统计学处理凊液,加入肌肉卫星细胞培养液(F10培养液+20%实应用spsS13.0统计软件处理,实验组FBS),移入由Ⅳ型胶原预先处理的10cm的培养皿,与对中国煤化工细胞混悬液重新移入由Ⅳ型胶原预先处理的10cm的2结类 CNMHG"置入37℃5%CO2培养箱,静置30~40min,然后吸取培养皿,再次进行预贴壁,使混杂在卫星细胞中的成纤2.1大鼠原代卫星细胞培养维细胞尽量通过贴壁被祛除干净。操作重复5~6次以倒置显微镜观察可见,绝大多数先贴壁的细胞为得到纯度幕棘肉卫星细胞。放置在CO2培养箱成纤维细胞,细胞较大,而肌肉卫星细胞体积较小,贴676东南大学学报(医学版)2012年12月,31(6)壁速度较慢,仍处于悬浮状态。经反复预贴壁后,肌肉2.2肌肉卫星细胞形成肌管的鉴定细胞消化悬浮液中成纤维细胞含量大大减少;静置贴肌管免疫细胞化学 myogenin及肌肉重链蛋白壁的为肌肉卫星细胞,体积较成纤维细胞小,当增殖速(MHC)反应阳性,其中 myogenIn表达在细胞核,可见度快,培养密度较大时,容易发生细胞融合,形成肌管;多个细胞核排列在肌管中;而MHC表达在细胞浆中将培养液更换为含2%马血清的分化培养液后肌管形(图2)。成更充分(图1)。2.3肌管计数、卫星细胞数量和形态随机计数,可见实验组肌管数量(图3)较对照组少,经统计差异有统计学意义(P<0.05)。 myogenIn染色显示卫星细胞的数量和形态在诱导之前两组无差异(图4);在诱导分化第7天,两组的肌管计数的差异有统计学意义(图5)。2.4 Western Blot检测乙醇对卫星细胞 myogenIn表达的影响在细胞培养的不同时间点( Days Culture),经乙醇作用卫星细胞 myogenin表达逐渐减少(图7)。虽然对照组 myogenIn表达也逐渐减少,但是实验组图1肌肉卫星细胞分化培养液诱导下形成的肌管Fig1 Myotubes formed by muscle satellite cells which induced myogenin表达下降更快,在诱导后第7天已几乎检测不by differential medium x 100Alexa 546DA鬥MereeMHCA.肌管内多细胞核对 myogenin荧光反应阳性;B.细胞核DAP染色;C.两D.肌管MHC免疫荧光反应阳性;E.DAP染色(下中);F.两图重叠TH中国煤化工CNMHG图2肌管免疫细胞化学检测A Nuclei of muscle cells are positive for myogenin; B. Staining of DAPl: C. merging of two picturesD Myotube is positive for MHC; E. Staining of DAPI( lower middle ) F. merging of two picturesFig 2 Immunocytochemistry for myotubes沈干,等.乙醇对肌肉卫星细胞 myogenin表达的影响677一对照纠同样以 Western blot检测细胞myoD及 myogeNin表达实验糾(图8),而mvoD表达实验组与对照组之间无显著性差异,但实验组 myogeNin明显表达下降。2.6肌肉损伤后新肌束形成及卫星细胞的变化实验组在乙醇饮食1个月后,取小鼠后肢未损伤的肌肉切片,光镜下观察可见肌束边卫星细胞数量相对较对照组少(图9),但差异无统计学意义(P>0.05)。小鼠肌肉损伤后2d,损伤部位切片可见肌束断裂,卫星细胞数量大量增加,新生卫星细胞容易结合BrU,图3肌管计数Br山U染色呈现阳性。但是对照组与实验组细胞数量Fig 3 Myotubes quantitation差异无统计学意义(P>0.05X图10)2.510T1/2(C3H)转染myoD质粒后myoD及在后肢损伤后7d,对照组与实验组损伤部位的肌肉切片,可见许多新形成的肌束,肌束内成串的细胞myogenIn表达细胞系10T2C3H)转染myoD质粒后,诱导2d核,与体外卫星细胞融合的状态相同(图11)。图4诱导分化前对照组(A)与实验组(B)细胞 myogenin荧光染色Fig 4 Before differentiation, myogenin staining for cells in control group( A )and exporimental group( B中国煤化工图5诱导分化1周对照组(A)与实验组( B )myogenin荧光染色YHCNMHGFig 5 Myogenin staining for myotube after cultured in differentiation medium for 1 week, control group( A ) and experimentalgroup678东南大学学报(医学版)2012年12月,31(6)图6诱导分化1周对照组(A)与实验组(BMHC荧光染色Fig 6 MHC staining for myotube of control group( a )and experimental group( B )after cultured in differentiation medium for 1b a b a b laelMyogenGAPDH图7 Western blot显示不同时间点(0~7d)实验组(a)与对照组( b)myogenin表达的变化, GAPDH为内参照Fig 7 Western Blot showed expression of myogenin in experimental group( a and control group( b )in different timeints( 1- 7 daysGAPDH图8细胞系10T2C3H)转染myoD后,诱导2d后, Western中国煤化工伤的肌肉切片,肌束边可Blot显示实验组a)及对照组 b)myoD及 myogenin表达Fig8 MyoD was transfected into 10T1/2( C3H ) then culturedCNMHInJuried muscle in control group( A )andrentiation medium Western Blot showed myoD andexperimental group( B ) satellite cells were beside of myotubesmyogenin expression in ethanol group a )and control group bHE×100沈干,等.乙醇对肌肉卫星细胞 myogenin表达的影响679线图10对照组(A)与实验组(B)损伤第2天的肌肉切片HE×100Fig 10 Section of injuried muscle( Day 2)in control group( A )and experimental group B ) the broken myotubes and increasednumber of satellite cells were shown HE x 100图11对照组(A)与实验组(B损伤第7天的肌肉切片HE×200Fig 11 Section of injuried muscle( Day 7)in control group( A) and experimental group B ), many myotubes were newly formedand many neuclei were arranged in chain HE X 2003讨论肌肉卫星细胞只存在于骨骼肌内,心肌和平滑肌内没有卫星细胞。随着年龄的增加,卫星细胞的密度长期酒精摄入是骨骼肌和心肌萎缩的主要原因。逐渐减少,到一定程度后,终身维持。在出生后一段时乙醇或其代谢产物对细胞均有毒性作用:乙醇脱氢酶间内,卫星细胞核的比例明显下降,这主要是因为随着可使乳酸产生,改变细胞的代谢;乙醇可以使线粒体膨卫星细胞的融合,而肌细胞核总数增加23。所以我大,脆性增加,引起线粒体的损害。本实验目的是探索们采用出生2~3d的大鼠,其肌肉组织中富含肌肉卫乙醇是否可通过损害肌肉卫星细胞而引起肌肉的萎缩星细胞。我们也曾以单肌纤维贴壁方法4培养出卫和损伤,或者影响肌肉损伤的修复。星细胞(结果未显示),但由于技术要求较高,卫星细肌肉卫星细胞又被称为肌肉干细胞,位于骨骼肌胞的产量有限。所以在需要大量卫星细胞的实验中我纤维的肌细胞膜与基底膜之间,其核较大、胞浆少,细们采用幼鼠肉糜消化法。胞器数量少。在损伤等情况下,卫星细胞被激活,分裂肌源性决定因子(MDF)在肌细胞分化中均发挥关增殖,参与肌肉的修复。键作用,这些因子包括M5、M6、 myogenIn和myoD肌肉卫星细胞具有自我更新的能力,以维持其数而 myogenIn是由Myf5和myoD激活的。在分子水平量的大体稳定。肌肉卫星细胞的自我更新通过两种机静止期細陷油谢的牛征是M5和myoD的制:一是由非对称性分裂所造成的,大部分的子细胞定迅速型于肌源性分化而另一部分的子细胞重新成为卫星M5中国煤化工早表达上调,随后出现CNMHGgenin及MHC是肌肉细胞阁;二是肌肉卫星细胞进行对称性分裂,其中一个分化晚期表达的蛋白56。刚从肌纤维分离出的卫星细激活卫星细胞可以退出细胞循环,重新进人静止状态,胞并不表达肌源性标志物My5和myoD,提示静止期卫并可以被再次激活进人细胞循环,以进行卫星细胞的星细胞更具原始性。所以我们主要以 myogenin为肌更新11肉标志,检测卫星细胞及肌管的肌肉特性680东南大学学报(医学版)2012年12月,31(6)本研究发现,乙醇对卫星细胞 myogenin表达有显著影响,而对myoD影响不显著。说明其作用的位点[参考文献]在肌肉发育的较迟阶段,使卫星细胞形成肌管数量较1] CONBOY IM, RANDOT A, The regulation of Notch signaling对照组少。在 Western blot检测中两组 myogenIn表达controls satellite cell activation and cell fate determination in也有差异。我们以myo质粒转染细胞系10T1/2postnatal myogenesis J ]. Dev Cell, 2002, 3( 3):397-409(C3H)细胞,诱导细胞向肌细胞分化,并同样以乙醇2 GIBSON M C, SCHULTZ E. The distribution of satellite cells处理,也发现乙醇在作用2d后使 myogenin表达下降and their relationship to specific fiber types in soleus and ex-tensor digitorum longus muscles J]. Anat Rec, 1982, 202(3)而对myoD表达影响不大。329-337乙醇会对身体带来多方面的影响,甚至可以影[3] IBSON M C, SCHULTZ E. Age-related differences inabsolut响人间充质干细胞的分化9。本实验也证实了乙醇lumbers of skeletal muscle satellite cells[ J] Muscle Nerv对肌肉干细胞的负面影响。为进一步验证乙醇对在体1983,6(8):574580肌肉的影响,我们给予实验动物乙醇饮食,并且在乙醇4] ROSENBLATT DJ, LUNT A, PARRY D J,etal. Culturing of饮食后1个月后制造肌肉损伤模型。而且处于增殖和satellite cells from living single muscle fibers explants[ J ].In分裂的细胞对BrdU染色显示阳性,肌肉的卫星细胞Vitro Cell Dev Biol Anim. 1995.31( 10): 773-779在肌肉损伤的情况下能够被激活。在肌肉损伤后2[5 COOPER R N, TAJBAKHAH S, MOULY V, et al. In vivo satel通过组织切片,我们发现卫星细胞数量大大增加;在损lite cell activation via Myf5 and MyoD in regeneration mouseskeletal muscle JI J Cell Sci, 1999, 112( Pt 17): 2895-2901伤后7d,这些卫星细胞融合形成新的肌束,肌束内细[61wEQ, PATERSON B M. Regulation of MyoD function in the胞核排列成串,与体外卫星细胞融合的表现一样。但dividing myoblast J ]. FEBS Lett, 2001, 490(3): 171-178可能由于动物乙醇饮食的时间较短,没有完全体现乙[7] YABLONKA RZ, RUDNICKIM A, RIVERA A J,etal.The醇的慢性中毒损伤,所以实验组与对照组在卫星细胞transition from proliferation to differentiation is delayed in sat-的数量以及形成的新肌束数量上差异无统计学意义ellite cells from mice lacking MyoD[ J ]. Dev Biol, 1999, 210我们也对损伤肌肉进行了PCR等方法检测损伤肌肉(2):440-45myogenin表达(结果未显示),亦未得到两组有显著差81HPA.HPD, ATALA A, et al. Ethanol alters the osteo-异的结果。在将来进一步的实验中,我们将延长乙醇饮食的时间,真正模拟慢性乙醇中毒的情形。Alcohol Clin Exp Res, 2010, 34(10): 1714-1722本实验首次通过对卫星细胞的培养来验证乙醇矿9JG0NGZ, WEZEMAN F H. Inhibitory effect of alcohol on osneogenic differentiation in human bor其向肌肉分化的影响,结果显示乙醇可使卫星细胞chymal stem cells[ J ] Alcohol Clin Exp Res, 2004, 28(3myogenIn表达下降,从而抑制其肌性分化。468-479《现代医学》简介《现代医学》是由教育部主管、东南大学主办的国家级核心期刊,1964年创刊,现已出版发行40卷。2013年由双月刊改为月刊。《现代医学》为中国科技论文统计源期刊,即中国科技核心期刊,多年来,《现代医学》一直被《中国核心期刊遴选)数据库》、《中国学术期刊综合评价数据库》、《中国科学引文数据库》、《中国期刊网》、《中国学术期刊光盘版)》、《中文科技期刊数据库》、《资源系统》、《天元数据网》《龙源期刊网》、《中国教育阅读网》全文收录,同时被《中国医学文摘》《中国药学文摘》各分册收录。从2011年3月开始和中国学术期刊(光盘版)电子杂志社正式签署了独家数字出版合作协议。《现代医学》向国内外公开发行,国际标准刊号:ISSN1671-7562、国内统一刊号:CN32-1659/R。其以中高级卫生工作者为主要读者对象,主要报道医疗卫生工作者在临床医学影像医学等方面的先进经验、科研成果以及与实践密切结合的基础医学硏究。设有专家论坛Fu中国煤化工论综述个案报道、误诊误治、中医中药、护理等栏目CNMHG自2009年起现代医学启用网上投稿系统(网址hp://w.xdyx.org.cn),作者可登陆后注册投稿,并跟踪稿件状态。通信地址:江苏省南京市丁家桥87号;邮编:210009;电话:025-83272479,83272481,83272483。E-m亙方数提@pub.seu,cd,cm