一种核-壳结构的枝化聚乙二醇大分子的合成

国防科技大学学报第28卷第3期JOURNAL OF NATIONAL UNIVERITY OF DEFENSE TECHNOLOGYVol .28 No.3 2006文章编号:1001 - 2486( 2006 )03 - 0037 - 03-种核- - 壳结构的枝化聚乙二醇大分子的合成王孝杰李效东'，刘东华2 ,刘克良3( 1.国防科技大学航天与材料工程学院湖南长沙410073 ; 2.湖南师范大学化学化工学院湖南长沙410081 ;3.军事医学科学院毒物药物研究所北京100850)摘要选择以三羟甲基氨基甲烷( Tris )为核,以单甲氧基聚乙二醇( mPEC)为外层分子通过官能团反.应，合成出一种核一壳型枝化PEG衍生物利用叔丁氧羰基酸酐((Boc)0)对Tris上的氨基进行保护对mPEG端羟基依次进行羧基化、酰氯化等活化处理通过酰氯与羟基的官能团反应合成出目标分子。产物分子保留了活性官能团氨基为其进-步的修饰反应提供了保障。通过红外光谱分析、元素分析及分子量测定,证实了产物与目标分子的结构相吻合。关键词:氨基保护枝化聚乙二醇核一壳结构冶成中图分类号:TB324文献标识码AA Novel Method for Synthesis of Core-shell TypeBranched PEG MacromoleculeWANG Xia-jie' LI Xiao-dong' ,LIU Dong-hua2 ,LU Ke-liang3( 1. College of Aerospace and Material Engineering , National Univ. of Defense Technology , Changha 410073 China ;2. College of Chemistry and Chemical Engineering , Hunan Normal University , Changsha 410081 China ;3. Institute of Pharmacology & Toxicology , Academy of Military Medical Science , Beijing 100850 ,China )Abstract :A novel core-shell type branched macromolecule was synthesized from the trid hydroxymethyl ) aminomethand( Tris ) andthe monomethoxypols( ethylene glycol I mPEG). The first step was to protect the amino group of Tris by using t-butyloxycarbonyl anhy-dride (( Boc )20 ) , then mPEG was activated by changing hydroxide terminal into acid chloride and carboxylation of mPEG was fulilleldbefore. The amino group was reserved so that it could be used as functional radical to modify the protein later. The product was con-firmned to inosculate with FT-IR ,EA and M . W. through infrared spectroscopic analysis , element analysis and mensuration of molcularweight.Key words protection of amino group ; branched PEG ; core-shell ; synthesis .蛋白质及多肽药物的生物利用度很低，很多还会引起严重的免疫反应通过对药物进行化学修饰可以有效地改善这些问题。在常用的化学修饰剂中聚乙二醇( PEG )及其衍生物因其所具有的两亲性、生物相容性、无免疫原性、无毒副作用等1-2]特点,而成为备受关注的化学修饰剂。人们已经在这方面开展了很多工作,也取得了一些成果。目前,在利用PEG作为修饰剂的研究中基本都是采用线形结构的聚乙二醇修饰剂3-4],例如mPEG琥珀酸基琥珀酸酯(mPEG-SS),mPEG琥珀酸基碳酸酯(mPEG-SC)等。近来有研究表明:使用枝化PEG修饰剂比使用线形PEG修饰剂可使酶的活性保持得更好[5],例如在对尿酸酶的化学修饰研究中发现,如果用枝化PEG作为修饰剂聚乙二醇化后酶活性为未修饰酶活性的32% ,而使用线形PEG ,聚乙二醇化后酶活性仅为未修饰酶活性的2.5%。另外,使用枝化的修饰剂可以大大降低修饰产物的结构分散性这在干扰素聚乙二醇化过程中得到很好的证明用线形聚合物修饰产生11种位置同分异构体而用枝化聚合物只有中国煤化工被聚乙二醇化6]。因此枝化的PEG衍生物在药物修饰领域具有重大YHCNMHG能团的化合物为核,以活化了的mPEG为外层分子通过官能团反应,合成出一种具有核壳结构的枝化PEG衍生物。由于合成的枝化PEG衍生物在修饰药物时需要有活性位点,本文选择三羟甲基氨基甲烷(Tris)作为核材料,收稿日期2005- 12-09作者简介王孝杰( 1970- - )男博士生，讲师。38国防科技大学学报2006年第3期并通过氨基保护使产物分子保留了活性官能团，为其进-步的修饰反应提供了保障。产物分子通过红外光谱分析、元素分析及分子量测定结果表明产物为目标分子。实验部分1.1仪器与试剂单甲氧基聚乙二醇( mPEG ,Mn= 750),ACROS公司;三羟甲基氨基甲烷( Tris),ACROS公司;叔丁氧羰基酸酐(( Boc )0),吉尔生化;二氯亚砜、二甲基甲酰胺、二氯甲烷、无水乙醇、甲醇、无水乙醚等均为国产分析纯试剂,使用前均进行了干燥处理。红外光谱仪, Nicolet Mangna IR-550 型,KBr 压片沅素分析仪,USA ,PE-24001型CHN元素分析仪液质联用仪,Agilent 1100 series LC-MSD 核磁共振仪,VarianINO-VA-300 ,TMS 为内标,CDCI; 为溶剂。1.2 合成方法1.2.1单甲氧基聚乙二醇酰氯(mPEG-COCl)的制备称取羧基化单甲氧基聚乙二醇(mPEG-CO0H)0.5g(自制),加入到装有球形冷凝管的三口烧瓶中。用滴液漏斗滴加二氯亚砜至过量,用氢氧化钠吸收氯化氢气体室温搅拌反应1h。水泵减压蒸馏除去过量的二氯亚砜,得到黄棕色固体用无水乙醚洗涤3次除去残余的二氯亚砜置干燥器中干燥以备下面实验。1.2.2三羟甲基氨基甲烷的氨基保护反应式如下:--OH-.OHHC/ CH-Ot- CH&-i-HN- OHTris(Boc)0Boc-Tris称取1.2g( 0.01mol )Tris ,加入到250ml三口烧瓶中,加60ml无水甲醇搅拌溶解后,再加2.2g(0.01mol )( Boc)20。 50下回流、搅拌反应10h旋转蒸发完溶剂得到白色固体在水中重结晶，得到产物1.8g产率为81.8%。1.2.3 核-壳型枝化大分子的合成CH3-0( CH2CH20 )。-CH2CH2COCl + Boc-Tris- ➢ Boc-Tris( mPEG);，i=1~3将mPEG-COCI溶于30ml二甲基甲酰胺中,加入Boc-Tis( mPEG-COCI与Boc-Tris 的摩尔比为3:1 ),用氢氧化钠吸收反应产生的氯化氢尾气,在50C下反应5h ,减压蒸馏溶剂,至溶液体积约10ml左右停.止加热冷却至室温用无水乙醚沉淀,色 谱柱分离得到淡黄色固体0.3g产率为55%。2结果与讨论2.1三羟甲基氨基甲烷的氨基保护(Boc-Tris)2.1.1 Boc-Tris的红外表征Boc-Tris的红外光谱如图1所示,在2500~ 3560cm-'处,原料Tris的氨基、羟基的宽强吸收峰消失,同时Tris的伯胺基的面内弯曲振动峰1588cm-消失,说明原料参与了反应,出现了氨基甲酸酯的组合特征峰3421em-1为N-H伸缩振动峰,1715em-1为C=0伸缩振动峰,1650cm-l为 N-H面内弯曲振动峰,1250cm-为N-CO-0反对称伸缩振动峰。中国煤化工2.1.2Boc-Tris的核磁共振表征YHCNMHGBocTris的'HNMR分析结果如图2所示δ= 1.44(9H , Boc)3.70( 6H ,-0( CH20H))5.32(3H ,0H),7.92( -CONH )。2.1.3 Boc-Tris的LC-MSD的表征Boc-Tris的液质联用谱如图3所示,白色晶体经液相色谱分离后,在t=2.201min处出现单峰，说明王孝杰等:一种核一壳结构的枝化聚乙二醇大分子的合成39该晶体为纯净物,m/z=221 处为分子离子峰而没有其他杂质峰质谱仪采用常压化学电离( APCI)法得到的就是分子离子峰几乎没有碎片离子峰。通过红外、液质联用及核磁共振分析表明得到的产物是目标产物。m^\.1FTTns4000300020001000图1 Boc-Tris 的红外谱图图2 Boc-Tris 的'HNMR谱图.Fig.1 FT-IR spectra of Boc-TrisFig.2 1 HNMR spectra of Boc-Tris2 250 000100 I2 000 0001 750 00080 I1 500 0001250 000601 000 00040750 000500 00020250 000012.3。45610020(; 1:30011min图3Boc-Tris的液质联用谱图Fig.3 LC- MSD spectra of Boc- Tris2.2核一 壳型枝化大分子( CSBM )的合成2.2.1 CSBM的纯化由于CSBM的分子量是聚乙二醇的3倍多它的分子体积较大极性基团也较多,因而硅胶对它的吸附作用强于对聚乙二醇的吸附薄层色谱结果显示聚乙二醇的Ry=0. 80,CSBM的R,=0.5。比移值的差别表明产物中未反应的mPEG可以通过色谱柱分离法除去。实验以80~ 100目的硅胶为填充剂无水乙醚一无水甲醇( 30:50 )为展开剂,进行色谱柱分离。合并含产物的淋下液旋转蒸发至少量溶液时,加无水乙醚沉淀得到白色固体干燥贮藏。2.2.2 CSBM 的红外表征CSBD的红外光谱如图4所示,1745em-I处出现较强的酯键特征吸收峰1110cm-1为聚乙二醇链段醚键伸缩振动吸收峰,说明mPEG通过生成的酯键接上了。1360cem-为叔丁基面内弯曲震动峰2888cm~1为链骨架C-H伸缩振动吸收峰。表1CSBM的元素分析结果Tab.1 The result of element analysis about CSBMCHO4000 3000 20000000理论% 54.2 8.8 0.6 36.4中国煤化工的红外谱图实测% 51.5 8.41.0 39.1pectra of CSBMMHCNMH G'(下转第70页)7(国防科技大学学报2006年第3期201 - 214.[ 16] Valiant L G. The Complexity of Enumeration and Reliability Problem-[ J]. SIAM Jourmal of Computing , 1979( 8) 410- 421.(上接第39页)2.2.3 CSBM 的元素分析产物的元素分析结果如表1所示。由于采用CHN元素分析仪,所以表中氧的数据为计算所得。实测值与理论值稍有偏差,可能是由于产物不是纯净物，核上连接的mPEG链不完全是三条,而是几种链数的混合物。2.2.4 CSBM的分子量测定本文应用凝固点降低法测定CSBM的分子量。以水作溶剂,△T/ 值为0.017C ,计算出平均分子量为2188。理论计算CSBM含三条链的分子量为2591含两条链的分子量为1801含-条链的分子量为1011 ,实测值为2188 ,可以推断所得产物是含三条链和两条链的混合物,可能还含有少量-条链的。3.结论以Tris 为核,以酰氯化的mPEG为外层分子,通过官能团反应,合成出一种具有核-壳结构的枝化PEG衍生物并通过Boc保护Tris的氨基,使产物分子保留了活性官能团,为其进一步的修饰反应提供了保障。产物分子通过红外光谱分析、元素分析及分子量测定结果表明产物为目标分子。参考文献:[ I ] Zalipsky s. Functionalized Poly( Ethylene Glycol ) for Preparation of Biologically Relevant Conjugatec[ J]. Bioconjugafe Chem. , 1995 , 6 :50 -165.[2] Roberts M J ,Benley M D , Harris J M. Chemistry for Peptide and Protein PEGylaion[ J]. Advanced Drug Delivery Reviews , 2002 ,54 :459 -476.[3] Palaparthy R , Wang H , Gulati A. Current Aspets in Pharmacology of Modified Henoglobin{J]. Adv. Drug Deliv. Rev. , 2000 ,40 2)185 -[4] Zalipsky s. 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