合成气发酵梭菌C.autoethanogenum的生长特性与CO发酵性能

华南理工大学学报(自然科学版)第42卷第11期Journal of South China University of TechnologyVol 42 No 112014年11月Natural Science Edition)November 2014文章编号:1000-565X(2014)11-0136-07合成气发酵梭菌C. autoethanogenum的生长特性与CO发酵性能徐惠娟梁翠谊!许敬亮!郭颖!张字!庄新姝袁振宏(1中国科学院广州能源研究所∥可再生能源重点实验室,广东广州510640;2.中国科学院大学,北京100049)摘要:为探讨合成气发酵乙醇的新工艺,对梭菌C. autoethanogenum的生长特性及CO发酵性能进行了研究.考察了不同碳源对C.α utoethanogenum生长的影响,发现木糖是其生长的最佳底物对生长培养基进行了改良,使C. autoethanogenu的菌体质量浓度提高2倍以上,代谢产物以乙酸为主,只产生少量乙醇.利用1L气体采样袋研究了C. autoetha-nogent的CO发酵性能,在1.0g/L酵母膏的发酵培养基中经过两次CO发酵后,乙醇质量浓度达3.464g/L,CO乙醇转化率达51.7%.研究表明:N2环境、180℃4MPa下,20min高温液态水处理蔗渣得到的水解液可用于C.α utoethanogenum的培养,培养液再进行CO发酵,经过一次发酵后得到的乙醇质量浓度为3.13g/L,CO乙醇转化率为46.9%,与之前两次发酵的结果接近,但是发酵时间大大缩短.关键词:合成气;乙醇;一氧化碳;气体发酵中图分类号:Q815doi:10.3969/j.issn.1000-565X.2014.1.020自1987年发现第一株可以利用CO或CO2、H2合成气乙醇发酵菌株37,此后,研究者们又陆续发进行生长并发酵产乙醇的微生物 Clostridiumψung-现了其他的一些合成气发酵菌株,包括 Clostridiumdahlin(C. ljungdahlii)之后,一种新的乙醇生产技 carboxidivorans(C. carboxidivorans)89)、 Clostridium术—合成气发酵应运而生该技术以煤、生物质 autoethanogenum(C. autoethanogenum)0、 Clostridia-或有机废弃物的气化合成气(主要成分为CO0、CO2 um ragsdale(C. ragsdale)12及 Alkalibaculum bac和H2)为原料,利用特定的微生物将其发酵为乙醇.chi(A.bci)(等这些菌株产乙醇的能力各不相由于气化过程可以将原料中的所有含碳有机物转同.据报道,C. ngdahlii在具细胞循环的连续搅拌化为合成气,因此包括木质素在内的一些难降解物罐式反应器(CSTR)中发酵,乙醇的质量浓度高达质都可以被利用;而且合成气生物转化具有反应条48g/L;C. carboxidivorans在鼓泡柱式反应器件温和、专一性强及对合成气中的某些毒害气体具(BCR)中发酵13d后,乙醇质量浓度达275g/L耐受性等优点12.除气化合成气外,一些富CO的同样在具细胞循环的CSTR中,A.bch连续发酵工业废气(如转炉气、电石炉气、黄磷炉气等)也可30d后的乙醇质量浓度达5g/L以上6.相较之下,以被合成气发酵徵生物利用及转化C. autoethanogenum的相关研究较少,而且在仅有的C. ljungdahli是最早被研究也是研究得最多的些报道中,其合成气发酵的乙醇质量浓度都在收稿日期:2014-04-3*基金项目:国家“863”高技术计划项目(2013AA065803);广州市科技计划项目(2014100220);生物反应器工程国家重点实验室开放课题(2014OPEN10);中国科学院广州能源研究所所长创新基金作者简介:徐惠娟(1971-),女,副研究员,主要从事燃料乙醇的生物合成研究H中国煤化工CNMHG通信作者:袁振宏(1953-),男,研究员,主要从事生物质能源的生化转化研究L-mau: yuanzhi( ms.ge.ac.cn第11期徐惠娟等:合成气发酵梭菌C. autoethanogenum的生长特性与CO发酵性能1370.5gL以下18.合成气发酵菌株基本都是严格厌氧箱中进行厌氧菌,因而通常采用厌氧瓶或血清瓶对它们进行1.2分析方法批式发酵研究,下层液相为培养基和菌体,气体底发酵液于4℃、12000r/min下离心10min,取上物充满上层空间但是对于一个气体底物发酵过程清.乙醇与乙酸含量采用 agilent7890A型气相色谱而言,这两种容器都存在一定缺陷:由于底物处于仪检测,载气为Ar,采用DB-FFAP毛细柱(30mx固定体积的上层气相中随着底物的利用,上层气0.25m×0.25μm)和FID检测器,进样口温度为相的压力会逐渐降低,不利于底物的进一步利用,250℃,检测器温度为300℃色谱柱先在40℃下保而且这种体积固定的玻璃瓶不便于监测、计量气体持5mn;然后以20℃/min的速度升温至140℃,保的利用情况有鉴于此,文中拟采用一种新的反应持3min;继续以40℃/min的速度升温至250℃,再容器来研究合成气发酵过程克服厌氧瓶或血清瓶保持3mim.柱流量为1mL/min,载气流率为的上述缺陷30mL/min,分流比为1:50C. autoethanogenum可以利用木糖,且木糖是其发酵液中残糖及水解液的成分采用 Waters2498生长的优良底物木质纤维素原料水解液中的一个高效液相色谱仪(HPC)检测, Shodex Sugar SH1O11重要组分即是木糖但这部分木糖较难被发酵利柱,以0.005m0/L的H5sO4作为流动相,流量为用因此,文中拟以 C autoethanogenum为研究对象,o.5mL/mim,柱温为50℃,Uv-R检测器,检测器温考察其对木质纤维素水解液的利用及CO发酵性度为50℃样品需预先离心(1200ymim,1omn)并能,探索气体发酵制乙醇的新工艺以0.22μm滤膜过滤1材料与方法气体组分检测采用 Agilent7890A型气相色谱仪, Agilent5A分子筛柱(8f×1/8″×2mm,60-801.1菌株与培养基目)和 Agilent Hayesep Q柱(6ft×1/8”×2mm,80所用菌株C. autoethanogenum DSM10061购自100目),进样器温度为200℃,分流比为20:1,柱流德国菌种保藏中心.量为3mL/min,TCD检测器温度为200℃.柱子先在生长培养基在DSM640培养基和 Rajagopa-60℃下保持3min,再以15℃/min的速率升温到lan培养基的基础上进行了改良,成分(每升)如250℃下:10mL无机盐溶液,10mL微量元素溶液,10mL通过检测600nm波长下菌液的光密度(OD)值维生素溶液,1.0g酵母膏2.0g蛋白胨,0.5g半胱来测量菌体密度,再根据OD值与干重的计量关系氨酸盐酸,50g吗啉乙磺酸,0.5mL0.1%刃天青,计算得到细胞干重.前期研究已知每一个OD对5.0g木糖,pH=6.其中,无机盐溶液组成如下:应的细胞干重为247mg/LNaC180gL,NH4C100g1,KC10gL,KH2PO41.3碳源对C. autoethanogenum生长影响的10g/L,MgSO4·7H2O20g/L,CaCl2·2H24g/L;微检测量元素溶液组成如下:次氮基三乙酸2g/L,MnCl2分别以葡萄糖和纤维二糖代替生长培养基中4H2O1.3g/L,Col2·6H2O0.2g/L,ZnSO4·7H2O的木糖保持质量浓度不变(5.0g/L),配制成相应0. 2g/L, FeCl, 6H200.4g/L, CuCI 2H,00 02g/L,的培养基,按10%的接种量接种活化后的C. autoeNiCl 6H,0 0.02 g/L, Na, MoO4 2H20 0. 02 g/L,NaWO42H2O0.025gL;维生素溶液组成如下:生 hanogenum至不同培养基中,于37℃培养箱中静置物素2mg/L,叶酸2mg/L,维生素B610mg/L,维生培养4d,取样检测ODa值及糖含量在100mL厌氧瓶中进行反应,培养基为50mL素B15mg/L,核黄素5mg/L,烟酸5mg/L,泛酸钙5mg/L,维生素B25mg/L,对氨基苯甲酸5mg/L1.4C. autoethanogenum生长曲线的测定发酵培养基不含木糖和蛋白胨,其余组分同生反应在500mL厌氧瓶中进行按10%的接种量长培养基,pH=6接种活化后的 C autoethanogenum至生长培养基中,配制好的培养基于121℃下高压蒸汽灭菌37℃下静置培养,定时取样检测ODo值残糖及产20min后,从灭菌锅中取出,立即放入厌氧操作箱中物质量浓度气5组成:N8%,H10%,0.5%),待培养基1.5气袋中国煤化工显示无色后加塞密封所有接种及取样等操作均在反应在CNMHG气袋大连德138华南理工大学学报(自然科学版)第42卷霖气体包装有限公司生产)中进行.气袋预先以N2充放气3次,再以CO充放气3次,然后在压力为■菌体质量浓度0.015MPa、流量为0.8L/min的条件下充气(CO糖利用率lmin,关闭旋塞按10%的接种量接种生长至对数期的C. autoethanogenum于发酵培养基中,混匀后用8600注射器抽取样品,从旋塞上的小孔注入气袋中,每个气袋加入55mL.气袋置于37℃培养箱中静置培葡萄糖纤维二糖养,待气袋完全扁下去后取样检测残留气体成分、OD值及产物质量浓度随后,按上述条件再次向气袋碳源充气(CO),重新灌充CO的气袋继续置于培养箱中培图1C. autoethanogenum对不同碳源的利用养,待气袋再次完全扁下去后同上进行第二次检测ig. 1 Utilization of different carbon sources by C. autoethano-CO乙醇转化率根据下式计算CO乙醇转化率=乙醉实际得率×100%=22C. autoethanogenum在改良培养基中的生长曲线乙醇生成量(mg)/46.07(g/mo)]×6消耗的标准状态CO体积(L)×4464(mMD)x100%图2为C. autoethanogenum在改良培养基中的1.6C. autoethanogenum对蔗渣水解液的利生长曲线从图中可以看出;第1天为生长延滞期;用实验从第2天开始,C. autoethanogenum进入对数生长甘蔗渣粉碎至40~80目,水洗后于105℃下烘期;第4天后进入稳定期菌株生长的同时伴随着干,以1:20的质量比与水混合,置于水解反应器中木糖的消耗及乙酸的生成而乙醇只在对数生长中进行水解,水解液冷却后于1200%m下离心期才开始被检测到,且量很少(小于Q.25gL),整10min,取上清以水解液离心后的上清代替生长培个生长阶段变化不大,说明乙酸是生长偶联型产养基中的木糖及水,配制成水解液培养基(pH=6).物而乙醇是非生长偶联型产物,这与 Klasson等2按10%的接种量接种生长至对数期的C. autoetha对C. nydahl的研究结果一致因为乙醇和乙酸nogenum于水解液培养基中,在37℃下静置培养是由中间代谢物乙酰辅酶A在不同酶的催化下转4d,取样检测ODa值、残糖及产物质量浓度.反应化而成的,生成乙酸能产生一分子ATP(三磷酸腺在100mL厌氧瓶中进行,培养基为50mL苷),生成乙醇则不能,因此菌体生长阶段的主要产物是乙酸此外,在改良培养基中培养4d后,C.al2结果与讨论toethanogenum的菌体质量浓度可达311mg/L,是之2.1碳源对C. autoethanogenum生长的影响前郭颖等2研究结果的3倍多德国菌种保藏中心推荐的C. autoethanogenum25.0500生长培养基中既含木糖,又含纤维二糖,而 Abrin面n一木糖等0认为C. autoethanogenum不能利用葡萄糖.文中分别以木糖、葡萄糖和纤维二糖为唯一碳源配制i aof-LM x awo i生长培养基,考察C. autoethanogenum对不同碳源的10菌体浓度利用情况,结果如图1所示.从图中可以看出:以木糖为碳源时 C autoethanogenum生长最好,菌体质量时间/h浓度及糖利用率都远远高于其他两种碳源;C.auoe图2C. autoethanogenum的生长曲线thanogenum在葡萄糖及纤维二糖培养基中都有少Fig 2 Growth curves of C. autoethanogenum量生长,但是糖利用率都较低(小于10%),其中对纤维二糖的利用最少这说明葡萄糖和纤维二糖都23气袋生长一发酵实验结果及分析不适宜作为C. autoethanogenum生长培养基的碳源CO发酵是一个厌氧气杰底物发酵过程,反应因此后续研究中均以木糖为生长培养基中的唯一式如下所示中国煤化工碳源4C0+2CNMHGo第1l期徐惠娟等:合成气发酵梭菌C. autoethanogenum的生长特性与CO发酵性能6C0+3H2OCH, CHOH +4c0阶段,消耗的CO主要用于菌体生长,菌体质量浓度该过程对反应装置的密封性能要求比较高,普得到较大增长,产物以乙酸为主醇酸摩尔比较低,通的厌氧瓶较难满足这一点这是因为,注入瓶中CO乙醇转化率也较低(小于16%);在第2阶段,消的CO可能从瓶口泄漏,而且CO被利用后会使得耗的CO有一部分仍用于菌体生长,表现为菌体质瓶内上层气相压力降低,存在氧气渗入的可能.文量浓度继续增加,但是更多的CO用于合成代谢物中采用密封性能良好的气体采样袋来研究C.auoe-乙醇,乙酸质量浓度相比第1阶段有所降低,乙醇thanogenum的CO发酵性能,反应前后的气袋变化质量浓度则显著提高;在1.0g/L酵母膏的发酵培如图3所示由于气袋具有弹性体积,随着CO逐步养基中,乙醇质量浓度达到3464g/L,CO乙醇转化被C. autoethanogenum利用,气袋的体积会逐渐缩率达51.7%.另外,0.8和1.0g/L酵母膏质量浓度小,这既便于观察又使得上层气相的压力相对稳下得到的最终菌体质量浓度基本相同,但是后者的定虽然发酵过程中会产生一定的CO2,但一方面消乙醇和乙酸质量浓度更高,尤其是乙酸.酵母膏作耗的CO摩尔数多于生成的CO2摩尔数,且C.auoe为培养基中的主要氮源供菌体生长利用,较高的浓thanogenum可以继续利用CO2(在一定还原力存在度有利于生长,而乙酸是生长过程中的主要代谢下),另一方面CO2较易溶于水所以最终气袋里的物,因此表现为产乙酸较多但第2阶段的乙酸质气体基本能耗尽.量浓度均出现不同程度的降低,酵母膏质量浓度为0.8g/L时更为明显,乙酸质量浓度降至0.252gL,使得最终醇酸摩尔比达到15.76,比酵母膏质量浓度为1.0g/L时的结果高很多. Klasson等在研究C. ljungdahlii时也发现降低酵母膏浓度可以提高产物中的醇酸摩尔比.由乙醇和乙酸的代谢途径得(a)反应前(b)反应后知,乙酸在乙醛氧化还原酶的催化下可转化为乙图3气袋变化图醛,进一步可继续转化为乙醇,因而可以认为,第2Fig 3 Variation of gas sampling b阶段乙醇质量浓度的增加伴随着乙酸质量浓度的表1为C. autoethanogenum的气袋生长-发酵降低,说明可能有部分乙酸转化为了乙醇因此在结果.发酵培养基中的酵母膏质量浓度分别为0.8一定范围内,较高的酵母膏浓度或许是有利的,虽和1.0g/L,整个生长-发酵过程进行了两次CO充然醇酸比有所降低,但可以获得更高的乙醇浓度,气操作每一阶段耗时20d左右,最后检测气袋中正如表1的结果所示关于这一点,笔者将在后续的余气只有CO2,没有CO.从表1可以看出:在第1研究中展开更深入的探讨表1C. autoethanogenum的气袋生长-发酵结果Table 1 Results of growth and fermentation of C autoethanogenum in gas sampling bag酵母膏质量浓度菌体质量浓度乙醇质量浓度乙酸质量浓度CO乙醇反应阶段/(g·L-1)最终pH值醇酸摩尔比/(mgL-1)/(gL1)/(gL-1)转化率/%第1次充CO0.8230.750.8第2次充CO650.63.04815.76第1次充CO0.7041.6114.260.57第2次充CO1.2713.5551.724C. autoethanogenum对蔗渣水解液的利用点是水解液中得到的木糖浓度不高,如果用于木糖高温液态水法是针对木质纤维素类生物质的一发酵过程需要先进行浓缩水解过程中产生的副产种绿色预处理方法,它可将木质纤维素中的半纤维物主要包括少量的糠醛、5羟甲基糠醛、葡萄糖醛素水解为木糖及其低聚糖,而且经高温液态水处理酸、乙醇酸、甲酸等,通常认为糠醛和5羟甲基糠醛后的纤维素原料更易于后续的酶解该方法具有不是发酵的主要中国煤化工察了这两种添加化学试剂、发酵毒性副产物少等优点23,缺物质对C.aCNMH响.表2为C140华南理工大学学报(自然科学版)第42卷autoethanogenum在不同水解液培养基中的生长情已耗尽,取样分析发酵液的OD∞产物质量浓度况及产物,水解液由不同条件的高温液态水处理蔗等,结果如表3所示.从表3可以看出,经过两天的渣得到从表2可看出:虽然水解液中木糖的质量浓培养,水解液培养基中的木糖已经用完,菌体质量浓度较低,但仍可用于C. autoethanogenum的生长;不度达142.1mg/L,产物中含少量乙醇培养液接入气过,随着5-羟甲基糠醛及糠醛质量浓度的升高,菌袋后,CO成为唯一的碳源,用于生长与代谢,表现为体质量浓度降低,说明这两种物质对菌株的生长有菌体质量浓度继续增加,乙醇质量浓度达到定的抑制作用.经比较,N2环境下180℃4MPa3.13g/L由于仍有部分CO用于菌体的生长,最终处理20mn得到的水解液较适合 C. autoethanoge的CO乙醇转化率为46.9%与表1的结果相比较,mum的培养,该条件正好也是蔗渣酶解预处理的一利用蔗渣水解液生长后再进行CO发酵,得到的乙个较优条件.醇质量浓度及转化率可达到单纯CO生长-发酵中以上述条件处理蔗渣,将得到的水解液与其他两次发酵的水平,说明该工艺是可行的,而且具有如营养物质混合制备水解液培养基,接种C. autoetha-下优点:①发酵时间大大缩短,由原来的40d左右nogent,在厌氧瓶中培养2d后直接将培养液转入减少到16d;②更多的CO被用于乙醇转化;③将木已灌注CO的1L气袋进行气袋发酵实验发酵14d质纤维素水解液中木糖的利用与CO发酵有机结合后气袋体积大幅度减小,检测发现上层气相中的CO了起来表2C. autoethanogenum在不同水解液培养基中的生长情况及产物Table 2 Growth and products of C autoethanogenum in different hydrolysate media各物质质量浓度/(gL-1)菌体质量浓度水解条件木糖5-羟甲基糠醛糠醛乙醇乙酸/(mg."-)180℃,4MPa,20min,N20.717112.9180T, 1. 5 MPa, 20 min, N,0.7300.0421.62200℃饱和蒸汽压,20min0.6310.158l.9791.7338.5表3C. autoethanogenum在蔗渣水解液中的生长情况及CO发酵结果Table 3 Growth and CO fermentation results of C autoethanogenum in bagasse hydrolysate medium各物质质量浓度/(gL)菌体质量浓度CO乙醇转化率样品木糖羟甲基糠醛乙醇/(mg.L-l)蔗渣水解液1.1520.0180.575培养液(2d)0.1290.974142.1发酵液(14d)3.13408.446.9中的乙醇质量浓度大大提高,在1L气袋中经过两3结论次CO发酵,乙醇质量浓度达3.464g/L,CO乙醇转通过考察 C. autoethanogenum对木质纤维素水化率达51.7%解液的利用以及它的生长与CO发酵性能,得到以(3)N2环境、180℃4MPa下,20min高温液态下结论水处理蔗渣得到的水解液可用于C1)木糖是C. autoethanogenum生长的适宜碳nm的培养,再偶联CO发酵该工艺的发酵结果可源但不适于乙醇合成代谢产物以乙酸为主.C.au-达到单纯CO生长-发酵时两次发酵的水平,而且toethanogenum在改良培养基中生长良好菌体质量发酵时间大大缩短CO转化为乙醇的效率提高浓度较之前的研究结果提高两倍以上2)由于具有弹性体积及良好的气密性能,气参考文献袋非常适合用于气体发酵的研究.C. autoethanoge[1] Vega Jt al. Sulfurnum能够以100%CO为唯一碳源进行生长并合成凵中国煤化工 methanogenic乙醇,虽然生长速度比以木糖为碳源时慢,但是产物CNMHGpd Biotechnology第11期徐惠娟等:合成气发酵梭菌C. autoethanogenum的生长特性与CO发酵性能141990,24/25(1):329340Bioresource Technology, 2011, 102(10): 5794-5799[2 Ahmed A, Cateni B G, Huhnke R L, et al. Effects of bio- [13] Allen T D, Caldwell M E, Lawson P A, et al. Alkalibacumass generated producer gas constituents on cell growthLum bacchi gen nov, sP nov, a novel CO oxidizing, ethanolproduct distribution and hydrogenase activity of Clostridi-um carboxidinorans P7[J]. Biomass and Bi[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary2006,30(7):665-672Microbiology,2010,60(10):2483-2489[3] Tanner R S, Miller L M, Yang D Clostridium Ljungdahli [14] Klasson K T, Ackerson M D, Clausen E C, et al. Biologi-sp nov, an acetogenic species in clostridial rRNA homolo-cal conversion of coal and coal-derived synthesis gasgy group I [J]. 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Archives of Microbiolo-599-6051994,161(4):345-351[11] Saxena J, Tanner R S. Effect of trace metals on ethanoldrolysis of sweet sorghum bagasse hemicellulose with liproduction from synthesis gas by the ethanologenic aquid hot water and its mechanism [J]. CIESC Joumaltogen, Clostridium ragsdale [J]. Journal of Industrial2012,63(2):599-605Microbiology and Biotechnology, 2011, 38(4): 513-521. [23] Yu Y, Lou X, Wu H. Some recent advances in hydrolysettemperature, pH and buffer presence on ethanol produc.Energy Fution from synthesis gas by"Clostridium ragsdale"[J]2008,2YH中国煤化工CNMHG142华南理工大学学报(自然科学版)第42卷Growth characteristics and carbon monoxideFermentation Performance of Clostridium autoethanogenumXu Hui-juan.2 Liang Cui-yi' Xu Jing-Liang Guo Ying Zhang Yu Zhuang Xin-shu' Yuan Zhen-hong(1. Guangzhou Institute of Energy Conversion/Key Laboratory of Renewable Energy, Chinese Academy of SciencesGuangzhou 510640, Guangdong, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)Abstract In order to develop the new technology of ethanol production from synthesis gas fermentaticharacteristics and carbon monoxide(co) fermentation performance of C autoethanogenum were investigated. Theeffects of different carbon sources on the growth of C autoethanogenum were analyzed and the results show that xylose is the optimal substrate. After the growth medium being modified, the cell density of C. autoethanogenum increased by more than 2 times, and the metabolic products were mostly acetic acid with a small amount of ethanolMoreover, the CO fermentation performance of C. autoethanogenum was studied in IL gas sampling bags. After twiceCO fermentation with C autoethanogenum in the fermentation medium containing 1. 0g/L yeast extract, an ethanolconcentration of 3. 464 g/L was achieved, and the yield of ethanol from CO reached 51. 7%. The investigation re-sults also indicate that the hydrolysate of bagasse treated with hot liquid water at 180C in a 4 MPa n2 atmospherefor 20 min can be utilized to culture C autoethanogenum, and the corresponding ethanol concentration and ethanolield from CO can reach 3. 13 g/L and 46.9%, respectively after only once CO fermentation, which are similar tothe results of the twice Co fermentation but with much less culture timeKey words: synthesis gas; ethanol; carbon monoxide; gas fermentation(上接第135页)Peanut Meal Fermentation by Bacillus subtilis BS H001 andCorresponding Product CharacteristicsLiu Dong-mei Chen Hao Hu Xiao-hui Wu Hui Li liSchool of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510640, Guangdong, China)Abstract: In order to improve the amino acid balance in peanut meal( PNM)and to reduce peanut protein allerBacillus subtilis Bs Hool is used for peanut meal fermentation and the fermentation conditions are optimizedThen, some characteristics of fermented PNM( FPNM) were analyzed. Orthogonal test results show that(1)theoptimal conditions of peanut meal fermentation by using Bacillus subtilis BS H001 are a water content of peanut mealof 52%, a fermentation time of 44h, a stirring interval time of 8 h, a sterilization time of 45 min and an ammoniunsulfate content of 4. 0%;(2)under such conditions, the total protein content of FPNM reaches 56.20%, which23. 49% higher than that of PNM, and the contents of non-essential amino acids, essential amino acids and totalamino acids in FPNM are respectively 4. 92%, 43. 97% and 16. 49% higher than those of PNM. SDS-PAGE electrophoresis shows that, three kinds of protein macromolecules in optimized groups 9, 13, 15, 16 of FPNM, whichare of the molecule mass6.4ud4 u respectively, earl中国煤化工 results demon-strate that the peanut meal fermented by bacillus subtilis bs Hool canKey words fermentation; BacilluCNMHrthogonal test