生物分子化学修饰用聚乙二醇衍生物的合成及应用

34●分子通2002年2月生物分子化学修饰用聚乙二醇衍生物的合成及应用姜忠义*,许松伟,高蓉(天津大学化工学院天津300072 )摘要聚乙二醇衍生物由于具有良好的生物相容性和免疫原性而被广泛应用于生物分子的化学修饰。本文就聚乙二醇衍生物的合成以及在生物医学和生物技术领域中的应用进行综述主要包括聚乙二醇衍生物的分类常用的聚乙二醇衍生物的合成方法及其性能,以及聚乙二醇衍生物的应用等。关键词聚乙二醇PEG )衍生物;生物大分子;化学修饰;合成;应用引言化学修饰作为提高多肽(包括蛋白质)核酸和多糖等生物分子的临床和生物学性能的重要手段得到了日益广泛的研究和应用2。化学修饰的效果好坏很大程度上取决于化学修饰剂的性能优劣。为此化学修饰剂的合成近年来-直吸引着世界范围内生物、医学和化学工作者的研究兴趣3]。迄今，已经有许多种类的修饰剂被相继合成出来。代表性的修饰剂4]有乙酰咪唑、卤代乙酸、N-乙基马来酰亚胺、碳化二亚胺、焦碳酸二乙酯、四硝基甲烷、N-卤代琥珀酰胺、乙=酸/丙二酸的共聚物、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯/顺丁烯二酰肼共聚物、多聚唾液酸S]聚氨基酸、葡聚糖、环糊精61及其衍生物、聚乙二醇( Polyethylene glycol ,PEG )及其衍生物等。其中聚乙二醇及其衍生物由于具有下述的优良性能而在化学修饰中应用最多[7。( 1 )PEG具有两亲性既可以溶解于水,又可以溶解于绝大多数的有机溶剂。(2 )PEG无毒免疫原性低其生物相容性也已经通过美国FDA认证。( 3 )PEG的分子量范围很宽从几百到数十万选择余地大。(4 )PEG可以将它的许多优良性质赋予修饰后的生物分子。本文综述了生物分子化学修饰用聚乙二醇衍生物主要包括聚乙二醇衍生物的分类,常用聚乙二醇衍生物的合成方法及其性能比较,以及聚乙二醇衍生物在生物医学和生物技术领域中的应用等。1聚乙二醇衍生 物的分类根据活化方式、电性、结构和端基等的不同聚乙二醇衍生物可有不同的分类方法。1.1按活化方 式的分类中国煤化工按照活化方式的不同分为同端基遥爪聚乙二.MHCNMHO。将PEC两端的羟基用不同的基团取代得到异端基遥爪聚乙二醇,如果两端时取代基团均为活性基团则称为异端双功能基遥爪聚乙二醇如果两个取代基团中一个为不活泼或者惰性基团,另外一个为活泼基团,作者简介姜忠义( 1966年- )搏士副教授研究方向酶与蛋白质工程。第1期分子通35则称为异端单功能基遥爪聚乙二醇。由于PEG两端同时活化不但要消耗较多的活化试剂,而且在化学修饰过程中容易发生交联有些情况下还不得不加入其它化合物来阻止或抑制交联反应的发生所以同端基遥爪聚乙二醇目前已经很少使用。异端双功能基遥爪聚乙二醇较难合成并且在用于化学修饰时也会象同端基遥爪聚二醇那样发生不期望的交联反应,因此实际应用也较少。相比之下异端单功能基遥爪聚乙二醇由于容易合成很少或不发生交联反应而得到了广泛的应用。1.2按端基的电性分类根据端基电性的不同聚乙二醇衍生物可以分为亲电和亲核两大类91。亲电类聚乙二醇衍生物比较常用种类也很多如ss- -PEQ PEG Succinimidyl Succinate ) SCM-PEQ( Succinimidyl ester of car-boxymethylated PEG ) ,BTC- -PEG( Benzotriazole carbonate of PEG ) ,SPA-PEG( PEG succinimidyl propi-onate ) SBA- -PEQ( PEG succinimidyl butanoate ) ,PEG2 NHS( PEG2 succinimide ) ,EPOX- -PEQ( PEG glycidylether) ,CDI- -PEQ PEG-Oxycarbonylimidazole ) ,NPC- PEC( PEG nitrophenyl carbonate ) ,ALD- -PEQ( PEG-aldehyde),NCO--PEQ(PEG-isocyanate)等。亲核类聚乙二醇衍生物有聚乙二醇胺类衍生物PEG-0-CH2CH2- -NH2、聚乙二醇巯基类衍生物PEG- -0- -CH2CH2- -SH等。.1.3 按链结构形状分类按链结构形状的不同聚乙二醇衍生物有线形、星形和梳形10]。线形聚乙二醇衍生物只包含一个聚乙二醇线形结构单元。星形聚乙二醇衍生物中包含若干个呈辐射状的聚乙二醇结构单元。其结构一般为[ x- ( CH2CH2O), 1- -z- +[( CHCH20).- -0H][6] ,x可以是胺基、羟基、羧基、醛基、巯基、卤素和环氧化物等Z可以是酰胺、氨基甲酸酯和酯类等;m、n一般为10~2000,a一般为1~5;b--般为1~100。星形的PEG一般只有一个相对活泼性较高的端基，这个活性端基可以在PEG的一端也可以在z上。聚乙二醇与马来酸酐等化合物形成的共聚物具有多个反应位点呈现梳形结构因而被称为梳形聚乙二醇衍生物结构如图171所示。CCH2-;CH- CH0CCOCH20 CH2H40 ).CH30一n图1梳形 PEG结构2常用的聚乙二醇衍生物的合成及其性能比较常用的聚乙二醇衍生物如图2所示。以下分别介绍它们的合成方法并比较它们在生物分子修饰时的性能。2.1 PEG 三嗪类衍生物中国煤化工这类修饰剂包括活化的PEG,[ 2( 0-methoxypoly.MYHCNMH Gr-s-triazine ]和PEC[(2,4-bi( 0-methoxypolyethyleneglycol )-6-dichloro- s-triazine]川。三聚氰酰氯上的氯原子与MPEQ(甲氧基聚乙二醇)上的羟基反应可以得到活化的PEG,和PEC2(分子式如图2中2和1)% PEG, 和PEC2上的游离氯原子可以分别在pH8~9和pH9.5~ 10与蛋白质的氨基反应。由于PEG2上有两个PEG链在修饰反应后能够更好地起到保护蛋白质的作用故修饰效果要比PEG好一些。Olsen 等7采36.高分子通2002年2月用如下方法制备出PEG2 4A分子筛和MPEC5000加入苯中回流干燥然后向上述混合物中加入氧化锌和三聚氰氯在80C下搅拌反应2d左右冷却到室温后再加入一定体积的苯。所得悬浮液进行过滤滤液经旋转蒸发浓缩至干即得PEG2。Abuchowski等同时还研究了PEG2的制备方法:MPEG5000溶解在无水二氯甲烷中加入冷的三乙基胺反应90min后加入乙醚搅拌3min,过滤出黄色沉淀,用乙醚洗涤后用乙酸乙酯除去其中的盐缓慢冷却至室温放入冰箱中进-步冷却即得产品。PEG- x'且m=2,.X=O。Q- -PEG3b m-3.X=O3c m=2.X=NH8PEG-0CI-^o- PEGPEG-OHPEG-O口->NC^ N0- -PEG62CIPEG-0- -CH2"-CI3PEG-0个~0-N40图2常见的PEG衍生物2.2 PEG 氨基酸类衍生物由于氨基酸本身就是构成蛋白质和多肽分子的重要组分,因此用氨基酸类物质作为PEG的端基将赋予PEG修饰剂更好的生物相容性。Yamasakf 121等人通过MPEG酸与正亮氨酸上的a-氨基或赖氨酸上的a-氨基和ε-氨基的反应制备出PEG的氨基酸类衍生物。PEG的氨基酸类衍生物可以通过N_羟基琥珀酰胺进一步活化。根据该思想通过丁沭步呕制夕出PEG,- GABA- -NHS :将中国煤化工PEG,(图2中所示加入到硼酸盐缓冲溶液中加入TYTHCNMH(过夜,用盐酸酸化后,用三氯甲烷萃取出PEG2- -GABA 重结晶两次后,用二氯申烷溶解,加入N_羟基琥珀酰胺( NHS和环己基碳二i亚胺( DCC)在室温下反应过夜得到PEG2- GABA- -NHS。 PEG2- -GABA- -NHS相对于PEG2有更高的生物活性用修饰SOD来比较它们的的活性。在pH=7.2 ,T=4°下,PEG2 不发生反应,只有在pH=11.0,T=4C条件下在16h内完成所需的修饰反应。而在相同的实验条件下第1期分子通37PEG2- -GABA- -NHS能在4h内完成95%的反应2/7的氨基残基发生反应;并且用PEG2- -GABA-NHS进行修饰时不会产生毒副产物。2.3 PEG 酰胺类衍生物PEG的N_羟基琥珀酰胺酯类衍生物在pH 7 ~9范围内可以直接与蛋白质上的氨基反应13。将PEG上的羟基衍生为羧基的最常用途径是通过羟基与琥珀酸酐之间的反应所得衍生物为PEG琥珀酰胺、琥珀酸酯如Ss- -PEG。 Abuchowsk{14]等 人报道了Ss- -PEG的制备过程:MPEG5000 加入到无水甲苯中然后加入丁二酸酐将混合物加热至150C控温反应5h。减压下蒸馏将甲苯蒸出，蒸馏残液用二氯甲烷洗涤然后加入乙醚沉淀产物。产物用二氯甲烷和乙醚重结晶得到丁二酰化的甲氧基聚乙二醇。丁二酰化的甲氧基聚乙二醇溶解到无水二氯甲烷中加入NHS和DCC在冰浴中溶解然后在室温下反应20h。副产物为固体，可通过过滤除去滤液加入乙醚后形成沉淀离心分出重结晶后得到产品Ss- -PEG 过程涉及的主要化学反应如下:1509MPEG- -OH + CH4O3 PMPEG- -OCOCH2CH2COOH( 1)MPEG一-0CH2 CH2 COOH+ NHS一> MPEG- -OCOCH2 CH2 CONHS(2)此外,有关PEG的羧甲基或羧乙基的琥珀酰胺衍生物如SC--PEG图2中4所示)的制备，ZalipkyfI5]等人开展了一些研究工作得到了如下制备方法:MPEG5000溶于苯(或者二氯甲烷)中,将光气溶于甲苯中与上述液体混合反应过夜将反应混合物蒸干剩余的光气在减压条件下蒸出，蒸馏残物重新溶于苯或二氯甲烷中加入N_羟基琥珀酰胺然后加入三乙苯胺将反应液过滤后重新溶于500°C下的乙酸乙酯中过滤出少量不溶物降温结晶得到产品。其主要反应过程如下:MPEG + COCl,一→>MPEG- -OCOCI(3)CCMPEG- -0C0Cl+ NHS一> MPEG- -OCNHS(4)2.4梳形 PEG衍生物聚乙二醇与马来酸酐之间通过共聚反应可以得到具有多个反应位点，呈现梳形结构(缩写形式为PM)。目前,已经制备出两种活化的PM共聚物:分子量为13 ,000 的活化PM，3和分子量为100000的活化PMop。蛋白质分子上的氨基酸与PM修饰剂上的马来酸酐直接偶合形成酰胺键。，这些梳形修饰剂具有独特的性质,如在蛋白质分子的表面覆盖上一个阴离子基团等。2.5 其它PEG衍生物除了用于修饰氨基的PEG衍生物以外还有用于修饰其它基团的PEG衍生物。例如,PEG 胺类衍生物可以用来修饰羰基化合物并且可以作为合成其它修饰剂的中间体。-种最有吸引力的途径是把马来酰亚胺PEG偶合到蛋白质的巯基上因为蛋白质上的游离半胱氨酸残基很少存在于蛋白质分子表面。最近的文献报道16] ,- -类新型的多功能PEG衍生物修饰剂通过如下过程合成出:SC- -PEG与溶于硼酸盐缓冲液的赖氨酸盐酸盐在pH 8. 0和室温下反应2d左右的时间后,用草酸将溶液pH值调至3。然后用二氯甲烷萃取用硫酸钠干燥后过滤滤液在乙醚中沉淀,可 以得到赖氨酸的两个氨基被两个PEC分支所取代的星形PEd中国煤化工ed Lysine )。2.6各种PEG衍生物的性能比较MYHCNMHGPEG衍生物修饰剂的性能的主要评价指标是偶合反应的活性与选择性、修饰剂本身和修饰反应副产物的毒性以及修饰反应产物的生物活性和稳定性17]。修饰剂的活性决定着修饰反应的条件为了保持生物分子的生物活性修饰反应应当在尽可能温和的条件下进行。修饰反应对生物分子.上特定的官能团的选择性决定修饰反应的专-性,也直接影响着修饰产物的其它性能,如免疫原38，高分子通2002年2月性等。修饰反应后生物分子的活性如酶的催化性能会发生变化不同的修饰剂对偶合物生物活性的影响不一样。另外,修饰反应往往是可逆反应,由于逆反应的发生,修饰剂分子也会从偶合物上脱落下来。不同的修饰剂与生物分子形成不同类型的键键能的差异导致偶合物的稳定性也不同。例如Ss- -PEG与赖氨酸氨基形成的是酯键,而SC- -PEG 形成的是尿烷键相比之下,尿烷键更稳定些18]因此其它条件相同的情况下,Sc- -PEG 与生物分子之间形成的偶合物要比ss- -PEG 与生物分子之间形成的偶合物稳定性好。表1列出常见的PEG衍生物用作修饰剂时的性能比较。表1常见PEG 衍生物修饰剂的性能比较1.1.18]1PEG衍生物反应活性毒性选择性修饰产物生物活性修饰产物稳定性PEG中大差PEG2ss- -PEG小SC-PEGSPA- -PEGPM.00PM33应用20世纪50年代生物化学家利用蛋白质的化学修饰来研究其空间结构和生物学功能19-21]。20世纪70年代后期,生物大分子的化学修饰开始引起学术界和应用部门的广泛关注”-2。1977年Abuchowski"等人证明PEG共价结合到牛血清蛋白或过氧化氢酶上可以降低它们的免疫原性。Sehon等人也报道了用PEG修饰过敏原可以抑制IgE类抗体的产生。在生物技术方面用具有两亲性的PEG修饰生物酶可以显著提高酶的催化性能这些发现拓展了用PEG对生物分子进行化学修饰的应用领域。1991 年PEG修饰的腺苷脱氨基酶( PEG- ADA )251成为通过美国FDA认证的第. -种修饰蛋白,它用于治疗因腺苷脱氨基酶缺乏引起的严重综合免疫缺陷症。下面就PEG在生物医学领域和生物技术领域中的应用分别加以介绍。3.1生物医学 领域迄今为止在生物医学领域仅PEG修饰的蛋白质就有100 多种已经用于临床用于疾病治疗26]。例如,Katre 和Knauf等人利用PEQ 5000 )修饰rhlL-2 形成偶合物改变了其原有理化性能使其疏水性变为亲水性分子量增加在体内的半衰期明显增加抗原性明显消失,且生物活性基本保持不变提高了rhIL应用效率。利用PEG修饰血红蛋白进行与血型无关的输血研究,延长血液的保存时间提高血液中的血红蛋白的寿命消除输血过程中的传染的疾病。表2给出了修饰后的生物大分子在生物医学领域的主要方向和应用实例。在生物医学领域，相关报道的比例大致为抗肿瘤蛋白占21%代谢酶占6%消炎蛋白占14%过中国国煤化工血液替代品占8%在其他方面,如脂、毒素等占28%。:fYHCNMHG3.2生物技术 领域在生物技术领域氧化还原酶占11%脂酶占16%蛋白酶占16%糖苷酶占3%，双水相分配占26%其它如NAD(P)和其它辅酶等占22%。表3说明了PEG-生物分子偶合物在生物技术领域中的应用方向和应用实例。第1期分子通表2修饰蛋白在生 物医学上的应用’应用方向.应用实例酶的遗传基因缺失症腺苷脱氨酸ADA )胆红素氧化酶嘌呤核苷磷酸化酶尿酸酶肿瘤治疗抗体天门冬酰氨酶集落刺激因子,干扰素白介素血液代用品血清蛋白,血红蛋白,免疫球蛋白肌红蛋白蛋白酶抑制剂消炎过氧化物岐化酶(SOD)过氧化氢酶抑制免疫反应卵清蛋白抗血栓抗血凝剂溶栓酶前凝血酶胰蛋白酶尿激酶其它碱性磷酸酯酶胎蛋白酶核糖核酸酶大豆胰蛋白酶抑制剂表3 PEG 偶合物在生物技术上的应用7]PEG偶合物应用领域氧化还原酶过氧化氢酶过氧化物酶有机溶剂中的氧化反应脱氢酶氧化酶生物反应器和生物传感器血红蛋白肌红蛋白生物传感器水解酶脂肪酶酯的合成和交换反应胰凝乳蛋白酶木瓜蛋白酶枯草杆菌蛋酰胺键和低聚肽的合成白酶嗜热菌蛋白酶胰蛋白酶纤维素酶ra半乳糖苷酶水解和糖基转移木质素黑色素增强亲水性氯高铁血红素卟啉叶绿酸氧化和光敏作用NAD( P)脱氢酶底物.二茂铁氧化还原作用中间体氨基酸核苷碳水化合物液相合成4结语.由于聚乙二醇具有前述的独特的物理化学性质所以聚乙二醇衍生物修饰剂在今后一段时间内仍会在各种化学修饰剂中占据主导地位。目前聚乙二醇衍生物修饰剂在反应活性和选择性，以及修饰后偶合物分子的稳定性和生物活性等几个方面往往只在某- -或某几个方面具有良好的性能所以综合性能优良的PEG修饰剂的研制和开发今后还有大量的工作要开展。除了聚乙二醇类的化学修饰剂外人们正在研究开发新颖多效的单功能低聚体如聚氨基酸葡聚糖聚丙烯酰吗啉[ poly( N-acryloylmorpholine ) ,PAcM ]和聚乙烯基吡咯烷酮[ poly( Nrvilypyroli-done)PVP等9。另外研究已经发现非聚乙二醇衍生物修饰剂与生物分子形成的偶合物在性质、器官定向、血液停留时间和免疫原性等方面均与聚乙-醇修饰的偶合物的性质有很大差别2728]。这也是非聚乙二醇衍生物修饰剂值得研究开发的另中国煤化工YHCNMHG参考文献:[ 1 ] Foroutan S M ,Watson D G. 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